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2025-05-25 03:30本頁(yè)面
【正文】 種方法有四種，即絨毛尿囊膜上接種法、羊膜腔接種法、尿囊接種法及卵黃囊接種法。（一）尿囊腔接種法（錄像） 【材料】 副流感病毒10－3稀釋液，10～12日齡雞胚、無(wú)菌1毫升注射器及7號(hào)針頭、電動(dòng)磨蛋器、檢蛋燈、彎頭小鑷子、蛋架、碘酒棉球、膠布、大頭針、無(wú)菌試管、無(wú)菌毛細(xì)吸管。 用鉛筆標(biāo)明天然氣室，雞胚及大血管位置，然后在絨毛尿囊膜發(fā)育區(qū)避開(kāi)大血管的地方作一記號(hào)，定為注射入口。 2. 用碘酒消毒注射入口和天然氣室端的蛋殼，再用電動(dòng)磨蛋器于注射入口和天然氣室端的蛋殼上磨一小孔，勿傷及卵膜。 4．將雞胚橫臥于蛋架上，用無(wú)菌1毫升注射器抽取病毒液體，針頭于卵殼成30176。 5．注射完結(jié)用膠布封口。用過(guò)的注射器用煮沸法消毒，雞胚放入35～37℃培養(yǎng)。注意雞胚必須直立，令氣室端朝上。 8．滴定尿囊液的病毒血凝效價(jià)。羊水卵白氣室卵黃囊尿囊液圖 101 雞胚尿囊腔接種法（二）絨毛尿囊膜上接種法（錄像）【材料】牛痘苗病毒10－3稀釋液、10～13日齡雞胚、橡皮乳頭、眼科鑷子或小剪刀、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌生理鹽水，其余同《尿囊腔接種法》。2．將胚蛋橫臥于蛋座上，使其絨毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒絨毛尿囊膜部位和天然氣室端的中心部，待干后即用磨蛋器輕輕在絨毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每邊一厘米許），磨破卵殼而不使卵膜破裂，同時(shí)用磨蛋器于氣室端開(kāi)一小孔。3．用分離針或大頭針通過(guò)火焰消毒，穿通天然氣室端所鋸小孔；并用分離針或大頭針輕輕劃破卵殼，露出三角形卵膜，最好將分離針或大頭針30176。4．立即用橡皮乳頭在天然氣室一端小孔吸氣2～3次，目的將天然氣室的空氣吸去，而上面所開(kāi)的洞口進(jìn)入空氣，形成一個(gè)人工氣室，可在照蛋燈上照視一下，看天然氣室是否消失，如未消失則尚需再吸氣數(shù)次（圖102）。用過(guò)的注射器煮沸消毒。7．將感染病毒的雞胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工氣室面，然后用鑷子撕去膠布并將卵殼的三角形窗口擴(kuò)大，以便剪取絨毛膜，此時(shí)在明亮處可清楚地看到牛痘斑，呈白色點(diǎn)狀，有時(shí)融合成一堆或一片。絨毛尿囊膜上接種法，除適用于天花，牛痘等病毒外，尚適用于單純皰疹病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、單皰疹病毒那樣具有明顯的病斑?！痉椒ā?．所用雞胚在使用前一天，將雞胚直立卵盤(pán)培養(yǎng)，使其胚胎向上，便于操作。 3．用小鑷子挑去方形卵殼和撕去卵膜，再用無(wú)菌吸管，吸取石蠟油少許，滴入2滴，石蠟油在氣室面的卵膜上很快散開(kāi)，使膜透明，這樣在雞蛋照明燈或檢蛋燈上，可清楚地觀察到整個(gè)雞胚。 5．注射完畢后，用膠布封口（膠布先經(jīng)碘酒消毒和通過(guò)火焰燒去余碘處理）。雞胚放入35～37℃培養(yǎng)48～72小時(shí)。收獲病毒之前將雞胚移入普通冰箱18～24小時(shí)，將雞胚凍死，以減少收獲時(shí)的出血。 8．滴定羊水的病毒血凝效價(jià)。 卵黃囊氣室卵白羊水尿囊液圖 103羊膜腔接種法四、病毒細(xì)胞培養(yǎng)法及病變觀察（錄像）細(xì)胞培養(yǎng)法是目前培養(yǎng)病毒應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)方法，其優(yōu)點(diǎn)是（1）經(jīng)濟(jì)適用，結(jié)果正確且敏感；（2）較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易于控制。很多組織細(xì)胞，包括雞胚、鼠胚、各種動(dòng)物的腎組織細(xì)胞，人胚羊膜組織細(xì)胞或流產(chǎn)胎兒組織細(xì)胞（應(yīng)在死后6小時(shí)內(nèi)采取，因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織細(xì)胞生長(zhǎng)成功率下降）等均可作細(xì)胞培養(yǎng)的來(lái)源。能引起病變的組織細(xì)胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細(xì)胞。（一） 原代細(xì)胞培養(yǎng)法【材料】9～10日齡雞胚、Hanks氏溶液、％胰酶溶液、無(wú)菌小剪、鑷子、無(wú)菌培養(yǎng)皿、毛細(xì)吸管、吸管、沉淀管、無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)管（抗生素空瓶）、100毫升無(wú)菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗。2．用小剪在培養(yǎng)皿內(nèi)將胚胎剪成小塊（4～5毫米3），加Hanks氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置1～2分鐘后，用毛細(xì)吸管吸取液體。3．用鑷子將組織塊放入無(wú)菌玻璃瓶或三角燒瓶?jī)?nèi)，加入10～％胰酶溶液，37℃水浴20分鐘，中間搖動(dòng)幾次。經(jīng)四層紗布過(guò)濾后的細(xì)胞懸液，低速離心沉淀（1000轉(zhuǎn)/分以內(nèi)）5分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營(yíng)養(yǎng)液，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，使成每毫升含50～80萬(wàn)細(xì)胞懸液以作單層細(xì)胞培養(yǎng)。置37℃溫箱孵育，一般4小時(shí)，細(xì)胞附著于管壁，48小時(shí)可長(zhǎng)成單層，此時(shí)即可調(diào)換營(yíng)養(yǎng)液，接種病毒。這種細(xì)胞能無(wú)限地傳代，但并不是所有的組織細(xì)胞都能建立傳代細(xì)胞。如HeLa細(xì)胞，Hep－2細(xì)胞及KB細(xì)胞。Hep－2細(xì)胞也曾用來(lái)分離脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組病毒、腺病毒、RS病毒。由于傳代細(xì)胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學(xué)的研究而不能用于疫苗的生產(chǎn)?！痉椒ā?．將成片細(xì)胞的生長(zhǎng)液倒掉，用Hanks液洗一次。3．將細(xì)胞瓶倒放，細(xì)胞在上，胰酶在下，繼續(xù)孵育37℃5～10分鐘。5．用生長(zhǎng)液按原量3～4倍稀釋，即一瓶細(xì)胞能傳3～4瓶?！痉椒ā?．取已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶二只，用無(wú)菌毛細(xì)滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。3．取出單層細(xì)胞瓶，蓋緊后置37℃孵箱中培養(yǎng)1～2天。注：為方便保存，此處觀察的細(xì)胞已經(jīng)過(guò)固定和染色。 血凝抑制試驗(yàn)適用于具有血凝素的病毒，試驗(yàn)必須預(yù)先滴定病毒的血凝效價(jià)，然后采用一定量的病毒，通常是加入4個(gè)血凝單位的病毒，在與血凝滴定試驗(yàn)相同的反應(yīng)條件下來(lái)進(jìn)行測(cè)定。 ml移液器、移液頭、小試管一支、
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