微生物學(xué)第八章微生物與基因工程-在線瀏覽
2025-03-07 01:37本頁(yè)面
【正文】 （ integrating plasmid） ?（ 2） 、 真核生物病毒載體 ① 、 哺乳動(dòng)物病毒載體 ② 、 昆蟲(chóng)病毒載體 ③ 、 植物病毒載體 人工染色體 ?酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome, YAC）是一類目前能容納最大外源 DNA片段人工構(gòu)建的載體 。 表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌 、 酵母或動(dòng) 、 植物細(xì)胞中得到高效表達(dá) ， 以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動(dòng) 、 植物的遺傳性狀 。 也即克隆載體只是攜帶外源基因 ， 使其在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增；表達(dá)載體不僅可使外源基因擴(kuò)增 ， 還可使其表達(dá) 。 表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件 ?表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件包括： – 啟動(dòng)子、 – 核糖體的結(jié)合位點(diǎn)、 – 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) – 密碼子偏愛(ài)性 – 等。 這是由于某些有價(jià)值的外源蛋白可能對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的 ， 外源蛋白的過(guò)量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長(zhǎng)；此外某些載體的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子 ， 如 T7啟動(dòng)子 ， 強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)非常強(qiáng)以致使正常宿主基因不能表達(dá) 。 第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)直至獲得足夠量的細(xì)胞 。 ?在原核基因表達(dá)調(diào)控中 ， 阻遏蛋白－操縱基因系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)的作用 。 加入誘導(dǎo)物 ， 使其與阻遏蛋白結(jié)合 ， 解除阻遏 ， 從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄 。 ?對(duì) DNA片段進(jìn)行操作 ， 必須要有能 “ 切短 ” DNA的得心應(yīng)手的工具 。 ?在分離目的基因或切割載體時(shí) ， 需利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì) DNA進(jìn)行準(zhǔn)確切割 。 限制性核酸內(nèi)切酶 ? 限制性核酸內(nèi)切酶 （ restriction endonuclease） 或簡(jiǎn)稱為限制性酶 （ restriction enzyme） 是指能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列 ， 并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割 DNA的一類內(nèi)切酶 . ?其作用是在分離目的基因或切割載體時(shí)對(duì) DNA進(jìn)行準(zhǔn)確切割。 ?EcoRⅠ 中 E是大腸桿菌屬名的第一個(gè)字母， co是種名的頭兩個(gè)字母， R是株名， Ⅰ 表示該菌第一個(gè)被分離出來(lái)的酶。 同尾酶：有些來(lái)源不同的限制酶，識(shí)別和切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。 ?DNA連接酶主要來(lái)自 T4噬菌體和大腸桿菌 。 它既能催化雙鏈 DNA中單鏈切口的封閉 ， 也能催化兩個(gè)雙鏈 DNA片段進(jìn)行連接 。 催化反應(yīng)需要 Mg2+和 ATP， ATP作為反應(yīng)的能量來(lái)源 。 另一種是大腸桿菌 DNA連接酶：大腸桿菌 DNA連接酶的相對(duì)分子量為 7 500Da， 連接反應(yīng)的能量來(lái)源是 NAD+， 此酶催化 DNA連接反應(yīng)與 T4 DNA連接酶大致相同 ， 但不能催化 DNA分子的平端連接 。 三、 微生物作為克隆載體的宿主 ? 為了保證外源基因在細(xì)胞中的大量擴(kuò)增和表達(dá) ， 必須選擇合適的克隆載體宿主 。 宿主 基本要求是： ① 能夠高效吸收外源 DNA； ② 具有使外源 DNA進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)； ③ 不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會(huì)使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源 DNA發(fā)生降解； ④ 一般為重組缺陷型（ RecA）菌株，使克隆載體 DNA與宿主染色體 DNA之間不發(fā)生同源重組； ⑤ 便于進(jìn)行基因操作和篩選； ⑥具有安全性。另外還有枯草桿菌和昆蟲(chóng)細(xì)胞系等。 一 、 目的基因的分離或合成 1， 從基因文庫(kù)中篩選 ? 基因文庫(kù)是指生物染色體基因組各 DNA片斷的克隆總體 （ 即某一特定生物體全基因組的克隆集合 ） 。 2， cDNA法 ? 目的 DNA可用反轉(zhuǎn)錄酶以 mRNA為模板來(lái)合成 。 ） cDNA文庫(kù)是指生物體全部 mRNA的 cDNA克隆總體 。 根據(jù)目的基因的特性可從中篩選 。 2kb的基因序列 。 三 、 重組 DNA導(dǎo)入細(xì)胞 ? DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后 ， 必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞 ， 使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀 ， 這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化 。 1， 外源 DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞 （ 1） 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 ? 如果外源 DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在 ，則可通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；如果外源DNA被構(gòu)建成重組噬菌體 DNA或重組噬菌體質(zhì)粒 ， 則可通過(guò)轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入細(xì)胞 。 體外包裝是將重組 DNA分子與噬菌體的頭部 、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合 ， 從而組裝成完整的具有感染力的 λ噬菌體粒子 。 （ 2） 外源 DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ? 微量注射和電穿孔法為主 ， 還有磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法 、 聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染法 、 原生質(zhì)體融合法等等 。 共培養(yǎng)法： ? 共培養(yǎng)法是指將含有重組 Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng) 。 基因槍法是利用微彈把表面吸附有外源 DNA的金屬微粒高速射進(jìn)植物的細(xì)胞 、 組織或幼苗 。 如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞壁再生等 。 在 DNA體外重組中 ，外源 DNA片斷與載體 DNA的連接反應(yīng)物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化 ， 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到100%的理想極限，因此必須使用各種篩選與鑒定手段區(qū)分
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