【正文】 雙峰，而表明含二種物質(zhì)。 1 色譜柱 如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰 都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會正常的。 2 溶劑極性及進(jìn)樣量 許多 HPLC 分析者對此可能不以為然，一般的 HPLC 的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為 20ul，此 條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰?。看味疾惶粯樱彝衔?，保留時(shí)間會提前（相對進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎?。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。 3 樣品的特性 有些樣品由于其化學(xué)結(jié) 構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個(gè)動態(tài)平衡存在。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在 LC－ MS 下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。 ？ 不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了， HPLC 系統(tǒng)由此而停止工作了。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。 相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩 端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。 PEEK（ polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？ 如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用 PEEK 材料制成的管路和接頭會非常方便。 使用此類材料的管路需要注意的是： PEEK 對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。 使用 PEEK 接頭時(shí)則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。 10. 液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響 許多色譜工作者在操作液相色譜時(shí)，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。但大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，因此若想將在某實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的一種液相色譜方法應(yīng)用到其 他實(shí)驗(yàn)室的話，溫度的差別就會引起較復(fù)雜的問題。 等度保留 大多數(shù)色譜工作者知道等度洗脫時(shí)溫度會影響保留時(shí)間。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度升高時(shí)所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時(shí)一般溫度每升高一攝氏度保留時(shí)間會縮短13%，在圖 1 中，保留時(shí)間變化率約為 2%/℃。在不同的季節(jié)，實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會使色譜峰離開“保留時(shí)間窗”，造成連續(xù)進(jìn)樣中產(chǎn)生一系列的無效數(shù)據(jù)。當(dāng)色譜柱正對著空調(diào)的送風(fēng)口時(shí)，雖然整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的溫度非常穩(wěn)定，但色譜系統(tǒng)的溫度就會不斷的變化。 梯度保留 溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。圖 1 中， 20℃的溫度變化引起保留因子的變化大約為兩倍，然而在圖 2 中， 40℃的變化使保留改變了約 20%。由此可見，溫度變化對梯度洗脫的影響要小于對等度洗脫的影響（假定本例具有普遍代表意義）。 選擇性的變化 比較圖 1和圖 2會發(fā)現(xiàn)溫度變化能引起選擇性顯著變化。從三個(gè)圖來看，對于前三個(gè) 峰的最佳分離條件是 35℃。 在圖 2 的梯度洗脫示例中，也有選擇性變化。 峰位置的相對變化和溫度的變化是有規(guī)律可循的。例如，在圖 2 中當(dāng)溫度升至 77℃以上時(shí)，峰 3 和峰 4 將會合并。溫度引起的選擇性變化的多年來一直未受重視。圖 1 中的樣品在 35℃時(shí)可以達(dá)到最佳選擇性（峰之間的距離最大），而圖 2 中的樣品在 38℃時(shí)可達(dá)到最佳選擇性（這兩份樣品的最優(yōu)溫度近似純屬巧合）。目前商業(yè)化的柱溫箱有兩種形式：直接加熱色譜柱和通過空氣傳熱，每種設(shè)計(jì)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，而且不同廠商設(shè)計(jì)的 LC 系統(tǒng)也有不同的限制。第三種設(shè)計(jì)是把色譜柱浸在液體中（比如水浴中），這在實(shí)驗(yàn)室中很容易搭建，但通常這種設(shè)計(jì)也并不比其他設(shè)計(jì)省力。例如，可把色譜柱置于泡沫塑料套中或色譜包裝盒中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室溫度基本不變時(shí)效果很好，但這種方法必須要允許保留有一些波動。 溫度平衡 我們知道，為了保證分離的重現(xiàn)性，色譜柱在梯度 洗脫狀態(tài)下的必須有平衡過程。例如，如果使用 B 溶劑5100%的梯度，柱子為 150mm180。 正如柱子不能完全平衡將導(dǎo)致保留時(shí)間的重現(xiàn)性差一樣，柱溫不平衡也會導(dǎo)致不理想的后果，這個(gè)問題在峰寬上的影響尤其明顯。升高溫度通常會使理論塔板數(shù)（ N）升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會越高，因此升高溫度可以達(dá)到更小的檢測限。但是，如果柱子是熱的，系 統(tǒng)的其他部分和溶劑是室溫，柱頭將比柱尾涼。 圖 3 所示色譜圖中柱溫為 38℃，進(jìn)柱的溶劑為室溫（約 22℃），最后一個(gè)峰有很明顯的變形。我們用 1 米長， 內(nèi)徑的不銹鋼管作為預(yù)熱器，把這個(gè)不銹鋼管盤成直徑大約10cm 的平面緊貼在柱溫箱里的預(yù)熱器上，再讓流路垂直以便預(yù)熱器能夠位于自動進(jìn)樣器和柱子之間，這樣，涼的溶劑從自動進(jìn)樣器里出來到柱子之前經(jīng)過這個(gè)預(yù)熱盤升高了溫度。有一些商品柱溫箱就包括這個(gè)預(yù)熱器。比較圖 35 你會發(fā)現(xiàn)這個(gè)問題很富戲劇性。在上述情況下當(dāng)使用了預(yù)熱盤以后峰型都變得很漂亮。 為什么會看到這些峰變形了呢？這很容易從峰展寬的角度來解釋。當(dāng)前面比后面走的快的時(shí)候 就會產(chǎn)生展寬的峰。雖然使用預(yù)熱器來改善峰形是一個(gè)很著名的結(jié)論（見參考文獻(xiàn) 3）但峰變形的原因仍然很復(fù)雜。但是很奇怪后出的峰變形問題比先出的峰要嚴(yán)重，正如圖 4 所示。 結(jié)論 我們發(fā)現(xiàn)柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個(gè)重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時(shí)間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最后，溫度的不平衡會導(dǎo)致峰扭曲變形。 原因 ① 柱溫波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線） ⑤流動相配比不當(dāng)或流速變化 ⑥柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時(shí) ⑦流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成 ⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高 K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。未調(diào)整檢測器。