hplc常見問題和對策(已修改)
2025-01-19 12:04 本頁面
【正文】 HPLC 色譜常見問題 HPLC 進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ ？ 靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 HPLC 分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ ODS 柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不重現(xiàn)，為什么？ HPLC 柱驗(yàn)收測試時柱壓過高，請問為什么？ ？ PEEK（ polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？ ？ ？ ？ ？ ？ ，還有哪些因素能引起壓力改變？ 、弱溶劑？ ？ ？ ？ ？ ？ “胖”峰和平頭峰？怎樣避免？ ？ ？ ？ ？ ？ ？ HPLC 的“無限直徑效應(yīng)”？ ？ ？ HPLC 進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ 關(guān)于漂移問題： ① 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 ② 流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等 ③ 柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡 關(guān)于快速變化問題 ① 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定 ② 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 ③ 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合 ？ ① 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖 洗柱子，替換篩板或更換柱子。 ② 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子 ③ 可能柱超載，減少進(jìn)樣量。 靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 ① 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 ② 樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子 ③ 樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器 ④ 檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 ⑤ 檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù) ⑥ 檢測器池窗污染 。解決辦法為清洗池窗。 ⑦ 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。 ⑧ 記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。 ⑨ 流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。 ⑩ 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。 HPLC 分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ ① 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理； ② 比例閥失效，更換比例閥即可； ③ 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； ④ 溶劑中的氣泡，解決的辦 法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法； ⑤ 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可； ⑥ 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。 ODS 柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現(xiàn)，為什么？ 這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的 ODS 填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的 ODS 柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如三乙基胺（ TEA），將會使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現(xiàn)性。 如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時間的重現(xiàn)。 HPLC 柱驗(yàn)收測試時柱壓過高，請問為什么？ 柱壓過高是 HPLC 柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。 ① 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查； ② 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗 ，若壓力下降，再檢查； ③ 將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用 10 倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過的柱子。 ④ 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。 判斷和處理 HPLC 分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。下面根據(jù)本人幾年工作的體會，提出一些看法，向同仁指教。 色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。 1 色譜柱 如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰 都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù) ，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。 2 溶劑極性及進(jìn)樣量 許多 HPLC 分析者對此可能不以為然，一般的 HPLC 的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前 HPLC 分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為 20ul，此 條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少
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