基因工程制藥ppt課件(2)-在線瀏覽
2025-02-22 09:17本頁面
【正文】 基因工程菌生長代謝的特點 基因工程菌的穩(wěn)定性 基因工程菌的發(fā)酵 基因工程藥物的分離純化 包含體的復(fù)性 基因工程藥物的質(zhì)量控制 基因工程藥物生產(chǎn)的過程 獲得目的基因 重組質(zhì)粒構(gòu)建 基因工程菌 除菌過濾 產(chǎn)物分離純化 培養(yǎng)工程菌 包裝 成品檢定 半成品檢定 基因工程的基本要素： 工具酶、目的基因、載體、宿主 上、下游 目的基因的獲得 一、構(gòu)建基因文庫 提取細胞基因組 DNA 酶切 克隆至特定載體 雜交或其他方式篩選 基因文庫 轉(zhuǎn)化特定宿主細胞 探針 (如根據(jù)氨基酸序列反推過來的DNA序列，根據(jù)蛋白保守性得到的同源序列，已知的部分 DNA序列 ) 獲取目的基因 適合于無內(nèi)含子的原核生物 二、構(gòu)建 cDNA文庫 適合于真核生物基因克隆。第二章 基因工程制藥 基因工程 是將一種生物的基因分離出來，在體外進行酶切和連接插入載體構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，導(dǎo)入另一種宿主細胞使目的基團得到復(fù)制和表達的技術(shù)。 基因工程可生產(chǎn)的主要藥物是指醫(yī)用 活性蛋白和多肽 ，包括免疫性蛋白、細胞因子、激素、酶等 。 提取細胞mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈的合成 雜交篩選或其他方式篩選 cDNA文庫 轉(zhuǎn)化特定宿主細胞 探針 獲取目的基因 cDNA片斷與載體連接 三、 PCR方式 先決條件：已知目的基因的 DNA序列。 四、化學(xué)合成 已知基因或蛋白質(zhì)全長序列，合成短的寡核苷酸片斷，拼接為長的 DNA片斷，再用連接酶連接成完整基因。 一、宿主細胞的選擇 首要條件： 能夠生產(chǎn)出有活性的目的產(chǎn)物 。 表達系統(tǒng)的分類： 原核表達體系 （ 1）大腸桿菌 ：目前采用最多的原核表達體系。 缺點： ? 缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，缺少糖基化功能 ； ? 沒有有效釋放蛋白到培養(yǎng)基中的分泌機制 ； ? 表達的外源蛋白多形成包涵體，蛋白的復(fù)性較困難 ； ? 翻譯目的蛋白 N端常多一個甲硫氨酸殘基（ AUG編碼）。 胞外分泌能力強； 有很多可用的質(zhì)粒載體； 無糖基化功能； 具有很強的胞外蛋白酶活性，對目的產(chǎn)物有不同程度降解。 缺點： 對其分子生物學(xué)研究不深入； 對外源基因表達的影響因素，特別是分泌機理還需系統(tǒng)研究。 具有分泌功能，能夠糖基化。 畢赤酵母轉(zhuǎn)錄外源基因的啟動子來自于畢赤酵母 醇氧化酶 I（ AOX1） 的啟動子， 受 甲醇 的嚴格調(diào)控，可使外源基因高效表達。 比其他的真核表達體系培養(yǎng)成本低，只需要含鹽的簡單培養(yǎng)基； 適于高密度培養(yǎng)，菌體干重可達 100g/L以上。 為了最大限度的穩(wěn)定畢赤酵母表達菌的穩(wěn)定性，已構(gòu)建的畢赤酵母載體均為 整合型載體； 轉(zhuǎn)化前在限制性內(nèi)切酶單酶切位點進行酶切使 載體線形化， 然后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，線形化的載體與酵母染色體發(fā)生同源重組插入到染色體中 。 （ 3）昆蟲細胞表達體系 以昆蟲細胞為表達宿主。 優(yōu)點： 糖基化的基因產(chǎn)物接近或類似于天然產(chǎn)物，可分泌表達。 二、大腸桿菌中的基因表達 1. 有效的表達載體 2. 密碼子偏好性 3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位 4. 蛋白降解 5. 融合表達 6. 分子伴侶 1. 有效的表達載體 典型的大腸桿菌表達載體主要包括：啟動子、操縱位點序列、多克隆位點、轉(zhuǎn)錄及翻譯信號、質(zhì)粒復(fù)制起點及抗性基因。 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒加強菌的代謝負荷，會影響菌體生長，不利于表達
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