【正文】 基因工程研究的內(nèi)容 主要內(nèi)容 ① 從供體細(xì)胞中分離出基因組 DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源 DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開（簡稱切）； ②用 DNA連接酶將含有外源基因的 DNA片段接到載體分子上，形成 DNA重組分子（簡稱接）； ③借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將 DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中（簡稱轉(zhuǎn)）； ④短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴增 DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中（簡稱增）； ⑤篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細(xì)胞（簡稱檢）。 工具酶就其用途而言可分為三大類：限制性內(nèi)切酶 、 連接酶 和 修飾酶 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） ? 核酸酶 =核酸外切酶 （ exonuclease） + 核酸內(nèi)切酶 （ endonuclease） 限制性核酸內(nèi)切酶的定義 ? 又簡稱限制酶或內(nèi)切酶 ，一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵，從而切斷雙鏈 DNA的核酸水解酶。 ? 首批被發(fā)現(xiàn)的包括來源于大腸桿菌的EcoR I和 EcoR II，以及來源于Heamophilus influenzae的 Hind II和Hind III ? ―帶剪刀的仆人”的故事 ——瑞士微生物遺傳學(xué)家 W 切點數(shù)目＝分子大?。▔A基對數(shù)） 識別序列頻率 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 同裂酶（ isoschizomers） ? 有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類酶稱為同裂酶。 （ a）切點位置相同 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ （ a）切點位置不同 CCCGGG GGGCCC C GGGCC CCGGG C + XmaⅠ CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC + SmaⅠ 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 同尾酶（ isocaudamer） ? 這一類的限制酶來源各異，識別的靶字序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BglⅡ AGATCT TCTAGA A TCTAG GATCT A 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 稀切酶 ? 有較長的識別序列和富含 GC或 AT的識別序列的限制性核酸內(nèi)切酶。 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 五、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素 DNA的純度 DNA的甲基化程度 酶切消化反應(yīng)的溫度 DNA的分子結(jié)構(gòu) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 ? DNA的純度 ? 污染在 DNA制劑中的 蛋白質(zhì) 、 酚 、 氯仿 、酒精 、 乙二胺四乙酸（ EDTA） 、 SDS（十二烷基硫酸鈉） 以及 高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。 ? 酶切消化反應(yīng)的溫度 ? 不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度 ? 大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是 37℃ ，但也有例外的情況 ? DNA的分子結(jié)構(gòu) ? 切割線性分子的效率明顯高于切割超螺旋的質(zhì)粒 DNA或病毒 DNA ? 識別序列的側(cè)面序列 ? 位點偏愛性 ? 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 ? 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組份包括： 氯化鎂 、 氯化納或氯化鉀 、 TrisHCl,223。 第二節(jié) DNA連接酶 一、 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) ? 1967年，世界上有多個實驗室?guī)缀跬瑫r而且獨立地發(fā)現(xiàn)。 第二節(jié) DNA連接酶 二、 DNA連接酶的連接機理 (演示 ) ? 一種封閉 DNA鏈上缺口酶，借助 ATP或NAD水解提供的能量催化 DNA鏈 539。OH生成 磷酸二酯鍵 。 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 E. coli DNA連接酶 ? 催化片段 互補黏性末端 之間的連接 ? 以 NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一種轉(zhuǎn)遞電子的輔酶）作為輔助因子 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 T4 DNA連接酶 ? 不僅能催化片段 互補黏性末端 之間的連接，也能催化雙鏈 DNA平末端 之間的連接 ? 以 ATP（腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷）作為輔助因子 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 Tsc DNA連接酶 ? 一種能夠在 高溫 下催化兩條 寡核苷酸探針發(fā)生連接作用 的核酸酶 ? 連接酶鏈反應(yīng)（ ligase chain reaction，LCR） 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 互補黏性末端片段之間的連接 ? 既可用 大腸桿菌 DNA連接酶 ，也可用 T4 DNA連接酶 ? 同種限制酶 切開連接后 保留原有切點 ； 同尾酶 切開連接后 失去原有的兩種限制性酶的識別序列 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 平末端片段之間的連接 ? 只能用 T4 DNA連接酶 ，但要增加酶用量 ? 同種限制酶 切開連接后 保留原有切點 ； 同尾酶 切開連接后 失去原有的兩種限制性酶的識別序列 ? 有的新連接片段還可能形成新的限制酶切位點 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 片段末端修飾后進行連接 ? DNA片段末端同聚物加尾后連接 ? 黏性末端修飾成平末端后連接 ? DNA片段 5‘端脫磷酸化作用后連接 ? DNA片段加連桿后連接 DNA片段末端 同聚物加尾 后進行連接 黏性末端修飾成平末端 后進行連接 DNA片段 5‘端脫磷酸化 作用后連接 DNA片段 加連桿 后連接 ? 寡核苷酸連桿（ linker） 是一種按預(yù)先設(shè)計化學(xué)合成的寡核苷酸片段，一般由 812個核苷酸組成，具有 一個或數(shù)個限制酶識別位點 的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。 DNA片段 加連桿 后連接 ? 銜接頭（ adaptor） 是一類人工合成的一類具有一種以上的限制酶粘性末端的寡核苷酸短片段。 第三節(jié) DNA聚合酶 ? DNA聚合酶以 DNA為復(fù)制模板，從 DNA由 5?端點開始復(fù)制到 3‘端的酶。 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 5′→ 3′的聚合酶活性 ① dNTPs（ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP）和 Mg2+離子 ②帶有 3′OH游離基團的引物鏈 ③ DNA模板，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 5′→3′的核酸外切酶活性 ①從 DNA鏈的 5′端向 3′末端水解已配對的核苷酸，切斷磷酸二酯鍵，每次能切除 10個核苷酸 ②通過 DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針 第三節(jié) DNA聚合酶 一、大腸桿菌 DNA聚合酶 I 3′→5′的核酸外切酶活性 ※ 從 3′→5′方向識別并切除 DNA生長鏈末端與模板 DNA不配對而游離的核苷酸 第三節(jié) DNA聚合酶 二、 Klenow片段 ※ 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 大片段（ klenow 片段），又叫做 Klenow聚合酶 或 Klenow大片段酶 ※ 作為商品提供的 klenow片段是用 枯草桿菌蛋白酶裂解 完整的 DNA聚合酶 Ⅰ 而產(chǎn)生或者通過 克隆技術(shù) 而得到的單一多肽 ? Klenow聚合酶的主要用途 ① 補平限制性內(nèi)切酶切割 DNA產(chǎn)生的 3′凹端； ② 用 [32P]dNTP補平 3′凹端 ， 對 DNA片段進行末端標(biāo)記； ③ 對帶 3′突出端的 DNA進行末端標(biāo)記； ④ 在 cDNA克隆中 ， 合成 cDNA第二鏈； ⑤ 在體外誘變中 ， 從單鏈模板合成雙鏈 DNA； ⑥ 應(yīng)用雙脫氧鏈末端終止法進行 DNA測序 。 第三節(jié) DNA聚合酶 三、 T4 DNA聚合酶 ※ 從一種攜帶有高表達 T4 DNA聚合酶質(zhì)粒的大腸桿菌中提純制備 ※ 具有 5′→3′聚合酶活性及 3′→5′外切核酸酶活性 ? T4 DNA聚合酶的主要用途 ① 補平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化 DNA后產(chǎn)生的 3′凹端 ， ② 對帶有 3′突出端的 DNA分子進行末端標(biāo)記； ③ 標(biāo)記用作探針的 DNA片段 。 外切酶活性 聚合酶活性 無 dNTP dNTP 5’CAGCAACGT 3’ dATP CAGCAACGT 3’ S1 T 3’ 3’GTCGTTGCA 5’T4聚合酶 A 5’ A 5’ 第三節(jié) DNA聚合酶 四、耐熱 DNA聚合酶 ※ 從嗜熱的水生菌 Thermus aquaticus