【正文】 . (3) Fluidised bed reactors do not clog as easily as fixed bed reactors. Fluidised bed reactors are however more difficult to design than fixed bed reactors. Design considerations include: (1) Setting the flow rate to achieve fluidisation (2) Ensuring that bubble size remains small during the fermentation. (3) Prevention of the cells from falling or sloughing off the particles. (4) Minimising particle damage. 絮凝細(xì)胞系統(tǒng) (Flocculated cell systems) In flocculated cell reactors, the cells are trapped in the reactor due to an induced or natural flocculation process. In flocculation cells tend to group together causing them to e out of solution and to sink towards the base of the reactor. Flocculated cell reactors are used widely in anaerobic waste treatment processes. In these reactors, the methanogenic and other bacteria form natural flocs. The flocs move due to the release of methane and carbon dioxide by the cells. The reactors are typically eggshaped. Flocculated cell reactors 第五節(jié) 固定化細(xì)胞的應(yīng)用 目前固定化細(xì)胞已成功地應(yīng)用在以下領(lǐng)域： 1，抗生素的生產(chǎn) 2，有機(jī)酸的生產(chǎn) 3，氨基酸的生產(chǎn) 4，酶制劑的生產(chǎn) 5，生物轉(zhuǎn)化 6，廢水處理 7，基因工程菌的固定化 一、抗生素的生產(chǎn) 抗生素是次級代謝產(chǎn)物，屬非生長關(guān)聯(lián)型，以游離細(xì)胞采用連續(xù)發(fā)酵很難生產(chǎn)抗生素。從理論上，阻止固定化細(xì)胞的增殖是可能的，因而可以使用較稀的培養(yǎng)基來連續(xù)合成抗生素。在發(fā)酵過程中，由于菌體的生長，導(dǎo)致發(fā)酵液粘度的上升，會影響氧的傳遞。 三、氨基酸的生產(chǎn) 例如固定化 Escherichia coli 和 Pseudomonas putida，將 D， L絲氨酸和吲哚轉(zhuǎn)化為 L色氨酸。絲氨酸和吲哚的摩爾轉(zhuǎn)化率可分別達(dá)到 91%和 100%。 四、酶制劑的生產(chǎn) 五、生物轉(zhuǎn)化 六、廢水處理 1，處理氨、氮廢水 微生物去除氨氮 需經(jīng)過硝化、厭氧反硝化兩個階段。采用固定化細(xì)胞技術(shù)可以做到這點(diǎn)。 2，含酚廢水 含酚廢水的處理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥產(chǎn)率高，易產(chǎn)生污泥流失，處理效率低等缺點(diǎn)。 3，含芳香烴廢水 利用固定化混合菌群可降解芳香烴廢 水。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞表現(xiàn)生長穩(wěn)定，降解能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。 七、基因工程菌的固定化 游離細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的質(zhì)粒高度不穩(wěn)定性可能是由于如下原因：質(zhì)粒的高拷貝數(shù)對細(xì)胞是有害的，并因此使具質(zhì)粒細(xì)胞在與不具質(zhì)粒細(xì)胞的競爭中處于劣勢。固定化基質(zhì)中的微小區(qū)室使細(xì)胞經(jīng)過有限 次的分裂形成小克隆， Nasri 等人發(fā)現(xiàn)無論接種量如何這些小克隆在釋放到培養(yǎng)液中去之前只能繁殖 10～ 16 代，在此過程中即使出現(xiàn) P細(xì)胞，也會由于延遲期的存在使其無法與 P＋ 細(xì)胞競爭而占據(jù)培養(yǎng)物中的大多數(shù)。隨著凝膠顆粒中細(xì)胞的生長，凝膠的剛性極大地降低，靠近凝膠顆粒表面的微孔破裂并將其中的細(xì)胞釋放出來。除了限制細(xì)胞分裂次數(shù)外，質(zhì)粒拷貝數(shù)的增加也使得質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高， Sayadi 等的實(shí)驗(yàn)表明： (pTG201)固定化培養(yǎng)物中質(zhì)粒拷貝數(shù)一直穩(wěn)定在 250 左右。因此，固定化培養(yǎng)細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的增加和凝膠中有限的細(xì)胞 分裂次數(shù)是提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的基本因素 第十三章 基因工程菌的發(fā)酵 近年來，重組 DNA 技術(shù) (基因工程 )已開始由實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)生產(chǎn)，走向?qū)嵱谩，F(xiàn)在由工程菌產(chǎn)生的珍稀藥物，如胰島素、干擾素、人生長激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不僅保證了這些藥物的來源，而且可使成本大大下降。 第一節(jié) 工程菌的來源和應(yīng)用 一、何謂基因工程 基因工程 （ geic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。重組即利用供體生物的遺傳物 質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA 分子，然后在將重組 DNA 分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。 基因工程一般分為 4 個步驟： 一是取得符合人們要求的 DNA 片段，這種 DNA 片段被稱為 “目的基因 ”；二是將目的基因與質(zhì)?；虿《?DNA 連接成重組 DNA；三是把重組 DNA 引入某種細(xì)胞；四是把目的基因能表達(dá)的受體細(xì)胞 挑選出來。 要把目的基因從供體 DNA 長鏈中準(zhǔn)確地剪切下來，可不是一件容易的事。阿爾伯博士、丹尼爾 史密斯博士第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內(nèi)切酶，它能夠在 DNA 上尋找特定的 “切點(diǎn) ”，認(rèn)準(zhǔn)后將 DNA 分子的雙鏈交錯地切斷。這種 “分子剪刀 ”可 以完整地切下個別基因。有了形形色色的 “分子剪刀 ”，人們就可以隨心所欲地進(jìn)行 DNA 分子長鏈的切割了。 1976 年，科學(xué)們在 5個實(shí)驗(yàn)室里幾乎同時發(fā)現(xiàn)并提取出一種酶，這種酶可以將兩個 DNA 片段連接起來，修復(fù)好 DNA 鏈的斷裂口。從此， DNA 連接酶就成了名符其實(shí)的 “縫合 ”基因的 “分子針線 ”。把 “拼接 ”好的 DNA 分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種分子小、能自由進(jìn)出細(xì)胞，而且在裝載了外來的 DNA 片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。有了限制性內(nèi)切酶、連接酶及運(yùn)載體，進(jìn)行基因工程就可以如愿以償了。因此，要知道導(dǎo)入是否成功，事先應(yīng) 找到特定的標(biāo)志。 二、工程菌的獲得 1，確定目的產(chǎn)物。 3，將細(xì)胞破碎后提純出全部信使 RNA。 4，利用基因擴(kuò)增技術(shù)（ PCR），找出所需的目的基因。 6，將重組后 DNA 分子引入到受體細(xì)胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條 件使細(xì)胞繁殖。 三、工程菌應(yīng)具備的條件 1，發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時是分泌型菌株。 3，菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。 5，能進(jìn)行適當(dāng)?shù)?DNA 重組，并且穩(wěn)定，重組的 DNA 不易脫落。 2，其它發(fā)酵產(chǎn)品 例如酶制劑、氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）、抗生素 等。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)。經(jīng)過重組的菌和質(zhì)粒一旦用于，工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進(jìn)入自然界。因此，安全問題是極其重要的。后 來，美、日等國都制定了有關(guān) DNA 重組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)則，即在試管內(nèi)用酶等構(gòu)建異種 DNA 的重組分子，并用它轉(zhuǎn)入活細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)，以及使用重組體的實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循的規(guī)程。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對實(shí)驗(yàn)安全度的評定，采用物理密封 (P1~P4)和生物學(xué)密封 (B1 和 B2)兩種方法。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在 20L以下時，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)組成。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。 企業(yè)中進(jìn)行重組菌培養(yǎng)時的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)有 LS1 和 LS2。 LS1 標(biāo)準(zhǔn)要點(diǎn)是： (1)使用防止重組菌體外漏，能在密閉狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)部滅菌的培養(yǎng)裝置； (2)培養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出； (3)使用易產(chǎn)氣溶膠的設(shè)備時，要安裝可收集氣溶膠的安全箱等。此外，培養(yǎng)后的菌體分離、破碎等處理也必須在安全柜內(nèi)進(jìn)行，或是采用密閉型的設(shè)備。但亦有其自身持點(diǎn)。其原因主要與基因工程細(xì)胞特點(diǎn)有關(guān)，首先基因工程細(xì)胞的生長速率及表達(dá)率與其所載外源 DNA 的穩(wěn)定性及產(chǎn)物分泌過程有關(guān)，