【正文】 ayer組裝概念，即層層組裝法[15]。自組裝多層膜生長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)力除了靜電作用還可以是氫鍵、共價(jià)鍵、配位鍵和疏水相互作用等，但研究最多的還是靜電層層自組裝。同時(shí)，LBL法制作工藝溫和，可在常溫水溶液中進(jìn)行，可以保持生物分子的活性。圖14 層層組裝及去核過(guò)程示意圖[16]層層自組裝微囊模板材料：[4,16]模板的選擇是LbL層層自組裝微囊制備過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。常用的模板有：（1）球形聚合物膠體粒子，如聚苯乙烯（PS）、三聚氰胺甲醛樹(shù)脂（MF）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸乙醇酸（PLGA）等膠體粒子；（2）鹽的晶體或無(wú)機(jī)粒子，如球形的CaCOMnCO3微粒、SiO2粒子等；（3）生物細(xì)胞，如大腸桿菌、血紅球等；（4）微乳液滴。如PS球形粒子可用四氫呋喃、甲苯等有機(jī)溶劑溶解；MF模板可在pH，因此可用鹽酸等去除；CaCO3可用鹽酸、EDTA溶解去除；SiO2粒子模板可用HF溶解去除；紅細(xì)胞可用次氯酸鈉氧化去除。m38形狀球球球discocyte多孔球單分散性非常好非常好好非常好好中等不好是否可以買(mǎi)到+++++/價(jià)格非常高中等低低/低需要解決的問(wèn)題機(jī)械強(qiáng)度、殘留物機(jī)械強(qiáng)度、殘留物團(tuán)聚化學(xué)壓力、壁破碎/殘留物層層自組裝微囊囊壁材料：囊壁材料的選擇是LbL層層自組裝微囊制備的另一個(gè)關(guān)鍵，這對(duì)實(shí)現(xiàn)微囊的功能化具有至關(guān)重要的意義。迄今為止，研究最多的體系是PAH/PSS組合。多糖類(lèi)如海藻酸鈉、殼聚糖、羧甲基纖維素、硫酸葡聚糖，多肽如精蛋白、聚賴氨酸和聚谷氨酸等都已成功用于LbL自組裝微囊的制備。層層自組裝微囊在固定化酶中的應(yīng)用層層組裝作為一種制作微囊的方法，有許多優(yōu)勢(shì)，因此也被用來(lái)制備包埋酶或其他生物活性分子的微囊。圖15 GOD和CAT酶的偶聯(lián)反應(yīng)提高微囊壁滲透性釋放胰島素的示意圖[50]Qi等以胰島素粒子為模板，交替吸附一定層數(shù)的葡萄糖氧化酶GOD和過(guò)氧化氫酶CAT，以戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，當(dāng)粒子接觸到葡糖糖后，葡糖糖被GOD氧化生成葡糖糖酸，pH下降，使得粒子的膜層微環(huán)境改變，通透性增加，粒子內(nèi)的胰島素逐漸的釋放[50]。前一種方法稱(chēng)為bottomup[2224]，從下至上的方法，即利用化學(xué)方法將基本的化學(xué)分子組裝起來(lái)獲得具有一定功能的模擬細(xì)胞的微囊；后一種方法稱(chēng)為topdown[20,21]，從上至下的的方法，即敲除生物中一些不必要的基因直至得到可以存活的最小基因組[26，27]。Bottomup一般是化學(xué)家所采用的方法，合成細(xì)胞外殼的物質(zhì)和方法通常有脂質(zhì)體、聚合物polymersomes、乳液法形成的外殼、層層組裝法形成的外殼。將大腸桿菌的細(xì)胞提取液、綠色熒光蛋白基因利用乳液法包埋在脂質(zhì)體里，形成微囊結(jié)構(gòu)，將微囊放于含有核苷酸和氨基酸的溶液里，可以檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，若將α溶血素包在脂質(zhì)體里，可使綠色熒光蛋白的表達(dá)時(shí)間持續(xù)4天[22]。以硅為模板，層層組裝形成外膜后去除模板，得到含有DNA和核酸內(nèi)切酶的微囊，加入二價(jià)陽(yáng)離子后，DNA被降解[34]。圖18包含BR和F0F1ATP 合成酶的脂質(zhì)體合成ATP示意圖[35]圖19 在polymersome中按順序包埋HRP ,CalB ,GOx三種酶[33]Topdown 作為生物學(xué)家常用的方法，通過(guò)不斷尋找能夠維持細(xì)胞自我維持、自我復(fù)制的最小基因組，將一套最小基因組轉(zhuǎn)入另一個(gè)細(xì)胞，可以使得另一個(gè)細(xì)胞的種類(lèi)發(fā)生徹底的改變[20]。近些年來(lái)，化學(xué)家和生物學(xué)家利用各自的方法創(chuàng)造著不同的人工細(xì)胞，但要真正達(dá)到細(xì)胞所具有的自我復(fù)制性、膜的選擇透過(guò)性、識(shí)別性能、自我修復(fù)和進(jìn)化，還是具有很長(zhǎng)的路。人工細(xì)胞向細(xì)胞邁出的一個(gè)大步應(yīng)該是人工細(xì)胞同生物之間的信息交流。人工細(xì)胞同生物之間的信息交流應(yīng)該分為兩類(lèi)：一類(lèi)是人工細(xì)胞發(fā)出信息，得到生物的響應(yīng)，如在人工細(xì)胞中合成一種糖類(lèi)，能夠引起海洋菌Vibrio harvei的群體效應(yīng)，產(chǎn)生熒光現(xiàn)象[29 ]。如LamB是一種能夠引起λ噬菌體釋放其DNA到宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，將這種蛋白質(zhì)包埋于微囊的膜中，形成的人工細(xì)胞可以“騙”過(guò)λ噬菌體，使其將DNA注入人工細(xì)胞中[36]。在工業(yè)應(yīng)用中，生物轉(zhuǎn)化往往也需要多種酶的共同協(xié)同作用生產(chǎn)某種產(chǎn)品。多酶的共固定化的優(yōu)勢(shì)除了酶固定化的固有優(yōu)勢(shì)外，還可以避免不同種類(lèi)酶之間的相互作用，縮短底物之間的傳質(zhì)路徑，利于最終產(chǎn)物的分離[38]。 混合固定化酶是將單酶分別固定到不同載體上在同一反應(yīng)體系重新混合。而多酶共固定化是將多種酶固定在同一載體上。最常用的方法是將兩種或三種酶按照一定的比例混合到同一載體中。. Torabi則是在珍珠巖上通過(guò)硅烷化共同固定了膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase )和 辣根過(guò)氧化酶（horseradish peroxidase ）[39]。K. S. Atia等人共固定用于生物催化，將β淀粉酶和麥芽糖酶包埋用于淀粉的糖化[40]。這和自然界中細(xì)胞的策略是類(lèi)似的[29]。在工業(yè)應(yīng)用中，生物轉(zhuǎn)化往往也需要多種酶的共同協(xié)同作用生產(chǎn)某種產(chǎn)品。圖112 一個(gè)在PSPIAT [43]而另一種引人注目的結(jié)構(gòu)是一種shell in shell 的結(jié)構(gòu)，即殼中殼結(jié)構(gòu)，最初由Zhifei Dai等人制造出，在模板MF上層層組裝PSS和PAH數(shù)層后，再加上一層硅，在層層組裝數(shù)層PSS和PAH，最后除去核，得到了shell in shell的結(jié)構(gòu)。Oliver Kreft等人利用碳酸鈣作為模板，采用類(lèi)似的方法，制造出了shell in shell的結(jié)構(gòu)，由于碳酸鈣的制作和最后去除模板的方法都十分溫和，對(duì)酶的活性影響不大，因此這種方法很適合包埋酶。圖113 合成殼中殼結(jié)構(gòu)微囊的一般步驟[44]這種結(jié)構(gòu)還被用來(lái)藥物傳遞過(guò)程中的遠(yuǎn)程控制，如Andre G. Skirtach在內(nèi)殼中加入金的納米顆粒，通過(guò)激光激發(fā)使得內(nèi)殼膜破裂，釋放內(nèi)殼中的藥物[46]。姜艷軍采用仿生鈦化過(guò)程構(gòu)建AlgProTi 雜化微囊作為多酶微工廠“廠房，以LbL 微囊作為工作車(chē)間，實(shí)現(xiàn)了多酶體系內(nèi)部的功能分割，便于單獨(dú)調(diào)節(jié)每種酶的催化特性可將不同酶種分別固定在LbL 微囊，shellsinShell結(jié)構(gòu)多酶微工廠中，囊壁孔徑分布主要集中在2~8nm，既能保證酶分子不泄漏，又能保證底物和產(chǎn)物分子的自由進(jìn)出。圖 114 capsulesinbead結(jié)構(gòu)的多酶微工廠的構(gòu)建 本文選題思路及主要工作酶的固定化對(duì)于酶的應(yīng)用起到非常重要的作用，當(dāng)前對(duì)于單個(gè)酶的包埋研究較多，對(duì)于雙酶以及多酶的固定化研究較少。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，結(jié)合課題組的優(yōu)勢(shì)，欲利用生物仿生硅化的層層組裝方法來(lái)制造一種shell in shell 的結(jié)構(gòu)，并且利用這種結(jié)構(gòu)包埋具有串聯(lián)作用的兩種酶，進(jìn)而檢測(cè)這種結(jié)構(gòu)在包埋多酶系統(tǒng)上的效果。而分區(qū)結(jié)構(gòu)中，shell in shell這種結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核細(xì)胞的結(jié)夠很相近，因此制備這種結(jié)構(gòu)來(lái)包埋兩種酶應(yīng)該可以獲得良好的效果。取20mL CaCl2溶液，加入60mg PSS粉末，使其完全溶解。將所得粒子用離心法快速收集，用水洗滌三次，貯存?zhèn)溆?。取一定量CaCO3 (PSS)微粒置于離心管中（粒子濃度約為1% w/w），用水洗滌兩次，每次洗滌后3000rpm離心3min以除去上清液。然后往組裝有一層精蛋白的粒子中加入30mM的硅酸鈉溶液，使粒子重新分散，孵化15min，期間輕微振蕩，然后離心去上清液，水洗兩次。 共沉淀制備碳酸鈣覆蓋(ProtamineSilica)2球中球結(jié)構(gòu)取約1/4上述帶有雙層(ProtamineSilica)2碳酸鈣核，重新分散于20ml CaCl2溶液中，加入60mg PSS以及 50mg PEG6000，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌5min，將20ml Na2CO3迅速加入，攪拌20s，靜置20min。 分離出 shell in shell 結(jié)構(gòu)將以上所獲得的微球分散于500ml 純水中，攪拌2mim，置于超聲中超聲5min，自然沉降34mim，除去上清液，獲得shell in shell 結(jié)構(gòu)的微球。以上過(guò)程重復(fù)35 次，以徹底除去碳酸鈣，去核后得微囊，以水洗滌三次，水中貯存?zhèn)溆?。噴金后采用掃描電子顯微鏡SEM 進(jìn)行觀察。TEM：將將微囊或微粒的懸浮液稀釋后滴在銅網(wǎng)上，在掃描隧道顯微鏡下觀察。BET：采用化學(xué)吸附儀（BET）測(cè)定顆粒的孔徑分布，在吸附測(cè)量之前樣品需在313K進(jìn)行24h脫氣處理，然后在77K測(cè)定氮?dú)馕矫摳降葴鼐€，用BJH法計(jì)算得到孔徑分布圖。采用透射法進(jìn)行測(cè)定。羅丹明B標(biāo)記：溶液1：配置4ml 1mg/ml牛血清蛋白的溶液，溶劑蒸餾水溶液2：配置1 ml 1mg/ml的羅丹明B，溶劑為甲醇將溶液1和2混合30min~60min，裝入事先煮沸10min的透析袋（殘留分子量為20kDa）中，置于蒸餾水中透析48h，每隔12h換一次水，以上所有過(guò)程均避光。51常用的分散劑有六偏磷酸鈉(SHMP)、多聚磷酸鈉(SPP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚羧酸鈉鹽、聚乙二醇[52,53,54]。超聲可以有效地減少納米或微米級(jí)粒子的團(tuán)聚，且在一定的超聲條件下，超聲不會(huì)減少酶的活力，故本文采用超聲方法減少碳酸鈣的團(tuán)聚。本文選擇了十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚羧酸鈉鹽（CMC）、聚乙二醇 6000進(jìn)行了分散研究。在第二次碳酸鈣成核時(shí)，將取約1/4上述帶有雙層(ProtamineSilica)2碳酸鈣核，重新分散于20ml CaCl2溶液中，同時(shí)加入一定量的分散劑，如下表：表23 加入分散劑的種類(lèi)和量1234加入物質(zhì)/SDSCMCPEG 6000加入量，mg/283350加入分散劑后，同時(shí)在增加攪拌轉(zhuǎn)速至1000rpm形成第二次碳酸鈣核，結(jié)果如下圖：圖21 加入不同分散劑的分散效果圖：a) 不加入分散劑；b) 加入SDS；c) 加入CMC；d) 加入PEG 6000由此可見(jiàn)加入的效果大小：PEG 6000CMCSDS,故以后的實(shí)驗(yàn)中，均選擇PEG 6000作為分散劑。當(dāng)加入到溶液中后，其分子鏈一端緊密的吸附于顆粒表面，另一端盡可能伸向溶液中，以減少顆粒之間的吸引力。PEG量過(guò)小，則它與顆粒之間的吸附力不足，另一端會(huì)使其吸附在其他顆粒上，使粒子容易沉降，PEG過(guò)多，則伸向溶液中的高分子長(zhǎng)鏈相互纏繞，顆粒也易沉降[55，56]。由于在第二次碳酸鈣成核過(guò)程中，仍有較多的碳酸鈣并不是在第一次的碳酸鈣核上生成的，所以會(huì)產(chǎn)生4181。m左右的兩種碳酸鈣，而前一種并不是本文所要獲得的結(jié)構(gòu)，所以要分離得到的混合物。m和8181。m，這兩種濾布理論上都可以用來(lái)分離4181。m左右的兩種碳酸鈣。L，ρS=，ρL=1g/cm3，181。C），則4181。m球狀碳酸鈣Vg=,設(shè)假設(shè)在5cm高的燒杯中裝滿水,則分開(kāi)兩種顆粒的時(shí)間為45min。而在簡(jiǎn)單的沉降條件下，分離效果比較良好，如下圖：圖22 超聲后對(duì)于沉降分離的影響a,不超聲直接重力沉降； b,采用超聲后重力沉降法分離故以后所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中均采用超聲5min后進(jìn)行34min的重力沉降。Ca2+和CO32混合后會(huì)立即成核，生成納米微粒，由于PSS 的存在，這些微粒被穩(wěn)定下來(lái)，進(jìn)一步自發(fā)聚集形成微米尺寸的CaCO3。利用EDX進(jìn)行元素分析,主要有C、O、S和Si 等元素組成，C、O、S元素的存在證明了精蛋白的存在，Si 來(lái)自于二氧化硅,證明了生物礦化的成功。一些研究者認(rèn)為870–880 cm?1是Si–O–Si網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的證明 。1090cm1屬于SiOSi吸收峰,一些研究者認(rèn)870–880 cm?1是SiOSi網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的證明[63]。上圖顯示了煅燒后LbL雜化微囊的氮?dú)馕矫摳降葴鼐€。該類(lèi)型的吸附等溫線表明了氧化硅材料介孔尺寸分布窄，孔連通性好，圖中的孔分布曲線也進(jìn)一步證明微囊的孔徑多集中在9nm 左右。 經(jīng)過(guò)超聲、沉降分離后獲得了比較均一的約8181。m碳酸鈣微球?yàn)榱耸姑阜肿幽軌蛴凶杂傻幕顒?dòng)空間，最后要將模板碳酸鈣去除，要選擇一種溫和的去除方式，不能破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶活力下降，根據(jù)文獻(xiàn)，176。如圖：圖210 去核后得到的shell in shell結(jié)構(gòu)：a) SEM 照片；b, c) TEM照片為了驗(yàn)證shell in shell結(jié)構(gòu)，如圖所示，先在內(nèi)層的碳酸鈣里包埋羅丹明B標(biāo)記的BSA，利用FITC標(biāo)記的精蛋白來(lái)進(jìn)行最外層精蛋白的組裝，在熒光顯微鏡下，可看到雙層結(jié)構(gòu)：圖211 熒光照片：a) 將羅丹明B標(biāo)記的BSA包入碳酸鈣；b) FITC標(biāo)記的精蛋白來(lái)進(jìn)行組裝；c) 雙熒光顯示的結(jié)果 小結(jié)本章研究了celllike shell in shell 載體的制備過(guò)程，并對(duì)制備的載體進(jìn)行了表征。m大小的模板，在模板上吸附精蛋白，可以誘導(dǎo)硅酸鈉形成納米顆粒的氧化硅。在第二次成核過(guò)程中，在CaCl2溶液中加入PEG6000約50mg，能夠使碳酸鈣得到很好的分散，超聲5min后重力沉降約34min，可以除去大部分4181。m碳酸鈣。這兩種酶可以發(fā)生如下反應(yīng)：這兩種酶可以被共固定用來(lái)檢測(cè)葡萄糖的含量。這種酶能夠氧化D己醛糖, D葡萄糖， ，在pH 47之間都有一定活性。葡糖糖氧化酶不需要任何的激活劑，但會(huì)被Ag+, Hg2+, Cu2+等阻遏，不會(huì)被非金屬SH所阻遏[59,60]。， 分子量為44 kDa，來(lái)自于植物辣根中，一個(gè)酶分子包括肽鏈(33890 Da)、血紅素、Ca2+（700 Da），碳水化合物（9400 Da），至少有七中異構(gòu)體。抑制劑有疊氮鈉(sodium azide), 氰化物（cyanide）, 胱氨酸（L–cystine）, 羥胺（hydroxylamine）, 硫化物（sulfide）, Cd+2