超高壓對(duì)胃蛋白酶酶解特性的影響畢業(yè)論文-在線瀏覽
2024-08-05 18:27本頁(yè)面
【正文】 ...................................................................................9參考文獻(xiàn) .....................................................................................................................11致 謝 .........................................................................................................................13 0引言酪蛋白具高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種全蛋白，在牛奶中的含量能達(dá)到 80%，常作為嬰幼兒的代乳品 [1]。采用蛋白酶對(duì)牛乳蛋白進(jìn)行適度酶解可以提高蛋白質(zhì)的利用率及生物價(jià)，避免了嬰幼兒的不良反應(yīng)。此外，酪蛋白酶解過(guò)程中，產(chǎn)生多種具有生理功能的活性肽 [4]。超高壓處理下，蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)中的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價(jià)鍵被打開(kāi)，使之變成無(wú)秩序的肽鏈狀態(tài)，而使得分子結(jié)構(gòu)伸展而變得松散 [8]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：酶活性中心的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，較低壓力可使常壓下完整組織中經(jīng)常被隔離的酶和基質(zhì)相接觸，加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行，從而暴露出更多結(jié)合位點(diǎn)，易于酶解反應(yīng)的進(jìn)行 [9]。Cheftel [10]在研究高壓對(duì)蛋白質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：壓力不僅可通過(guò)解鏈、離解或蛋白質(zhì)水解提高肉的嫩度，且可通過(guò)解鏈增加蛋白質(zhì)食品對(duì)蛋白酶的敏感度，提高可消化性和降低過(guò)敏性。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)單因素法確定不同的壓力、保壓時(shí)間作用，酪蛋白變性特性，以水解度為特征性指標(biāo)，研究該蛋白在胃蛋白酶作用下，以高壓處理的胃蛋白酶水解酪蛋白，測(cè)定其酶解產(chǎn)物的水解度、不同氮形式（可溶性氮、氨基氮、肽基氮）及含量，并通過(guò)對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量、疏水性的分析，研究了高壓處理對(duì)胃蛋白酶酶解特性的影響，以期為進(jìn)一步探索超高壓促進(jìn)胃蛋白酶酶解的機(jī)理打下基礎(chǔ)。主要試劑：甲醛，鹽酸，三（羥甲基）氨基甲烷（Tris） ，乙二胺四乙酸（EDTA）二鈉，甘氨酸，尿素， 5,5’二硫雙2硝基苯甲酸，三氯乙酸，磷酸鹽，1苯胺基8萘磺酸等。 儀器設(shè)備 超高壓處理裝置（包頭科發(fā)公司） ；多功能真空包裝機(jī)：山東省諸城市中鼎機(jī)械；SHAC 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市華峰儀器有限公司； PHS3C型精密 pH 計(jì)：上海雷磁儀器廠；KjeltecTM8400 全自動(dòng)凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS Denmark；TU1810 型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MULTIFUGE XIR 型冷凍離心機(jī) Thermo German；ALPHA12LD 型冷凍干燥機(jī)，Christ German；凝膠色譜儀。 超高壓處理 酶溶液用聚乙烯塑料袋真空密封包裝(50mL/袋 )，置于4℃的冰箱中保存(待用)。 酶解反應(yīng) 將一定量的酪蛋白在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入到處理過(guò)的酶溶液及對(duì)照液中，制成底物濃度為10mg/ml的懸浮液，置于水浴恒溫振蕩器中55℃酶解6h(反應(yīng)體系的pH、酶濃度、底物濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間已經(jīng)過(guò)優(yōu)化)。 指標(biāo)的測(cè)定 酶解液水解度的測(cè)定 甲醛滴定法測(cè)酶解液水解度的測(cè)定 [17,18]，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混勻后取20mL置于200mL燒杯中，加入60mL去CO 2水， mol/。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，計(jì)算水解度（DH） 。 氨基氮、可溶性氮和肽基氮含量分析 氨基氮含量測(cè)定：采用甲醛滴定法 [19]。 肽基氮含量測(cè)定：水解物上清液中肽基氮含量占原料總氮量百分比，即水解產(chǎn)物中可溶性氮含量與氨基氮含量之差。 巰基含量分析：， Tris—Gly—8MUrea溶液， DTNB溶液(4mg/mL用Tris—Gly緩沖液配制)，迅速混合后在25℃下保溫反應(yīng)30min，用分光光度計(jì)測(cè)定它在λ=412nm下吸光度值(A 412)，同時(shí)測(cè)定空白值(以蒸餾水代替樣品測(cè)定)。計(jì)算公式如下： μmol SH/g= D/C =106/(104)，104是Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)；A 412為λ=412nm下吸光度值； D為稀釋系數(shù)，這里D=；C為樣品的蛋白質(zhì)最終濃度，單位為mg/mL。本實(shí)驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng) λex=338nm ，發(fā)射波長(zhǎng)λem=496nm 。2結(jié)果與分析 不同壓力及保壓時(shí)間對(duì)酶解液水解度的影響 壓力大小對(duì)酶解液水解度的影響圖 壓力大小對(duì)水解度的影響 由上圖可以看出，隨著壓力的逐漸增大，酪蛋白經(jīng)超高壓處理胃蛋白酶酶解液產(chǎn)物，其水解度指標(biāo)，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且100MPa 時(shí)達(dá)到最大% ，在100MPa到200MPa間壓力對(duì)酶解液的水解度影響趨于平緩，而在50MPa到100Mpa間，酶解液水解度漲勢(shì)明顯。 不同壓力及保壓時(shí)間對(duì)氮存在形式及含量的影響。 保壓時(shí)間對(duì)氮存在形式及含量的影響5圖 保壓時(shí)間對(duì)氮存在形式及含量的影響由上圖可知，經(jīng)超高壓處理的胃蛋白酶酶解液產(chǎn)物，主要以可溶性氮、氨基氮、肽基氮形式存在，在最佳壓力下，其中隨著保壓時(shí)間的逐漸增加，可溶性氮及肽基氮含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在15min時(shí)含量最低；氨基氮含量一直處于不
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