【正文】 PN / 100g(mL)n 現(xiàn)方法： MPN / g(mL)大腸菌群 PetrifilmTM測試片法n PetrifilmTM大腸菌群測試片 是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有 VRB 培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和 TTC指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性，LST中的選擇性抑菌劑是月桂基硫酸鹽，相對于膽鹽穩(wěn)定性更好些。大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群定義： 一群在 36℃ 條件下培養(yǎng) 24~48小時(shí)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。報(bào)告n 當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表 1要求時(shí)，報(bào)告 25 g（ mL）樣品中檢出創(chuàng)傷弧菌。n API 20E生化鑒定試劑盒：刮取 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，用 3％氯化鈉溶液制備成濁度適當(dāng)?shù)募?xì)菌懸浮液，使用API 20E生化鑒定試劑盒鑒定。1 ℃ 培養(yǎng) 24 h～ 48 h后觀察結(jié)果。創(chuàng)傷弧菌在無氯化鈉、 8％氯化鈉和 10％氯化鈉的胰胨水中不生長，在 6％氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。n 嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水， 36 ℃ 177。1 ℃ 培養(yǎng) 24 h，在加 VP試劑前應(yīng)先觀察動(dòng)力。創(chuàng)傷弧菌在 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，偶爾斜面變黃。n 挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層， 36 ℃ 177。n 涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。1 ℃ 培養(yǎng) 18 h～ 24 h。分離平板 ——mCPC 和 CC 典型的創(chuàng)傷弧菌在 mCPC和 CC平板上呈現(xiàn)為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落，直徑 1 mm～ 2 mm。于 39 ℃ ～ 40 ℃ 或 36 ℃ 177。分離n 對所有顯示生長的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下 1 cm內(nèi)沾取一環(huán) ，于mCPC或 CC平板上劃線分離。置 36 ℃ 177。 n 另取 1 mL滅菌吸管，按上條操作依次制備 10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用 1支 1 mL滅菌吸管。1 ℃ 培養(yǎng)12 h～ 16 h。如無均質(zhì)器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后放在 500 mL的滅菌容器內(nèi)，加 225 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。n 魚類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。 1 ℃ ， 18 h～ 24 h36 ℃177。大陸沿海地區(qū)也時(shí)有創(chuàng)傷弧菌散發(fā)感染的報(bào)告創(chuàng)傷弧菌（ Vibrio vulnificus）n 1976年首次發(fā)現(xiàn)n 引起 傷口感染n 致死性的原發(fā)性敗血癥n 胃腸道感染n 曾稱為乳糖陽性弧菌n 革蘭氏陰性嗜鹽菌n 兼性厭氧n 3個(gè)生物型36 ℃177。食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制 內(nèi)容 O157 :H7/NM檢驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)n 沒有國標(biāo)n 食物中毒診斷n 國外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)n 美國 FDA BAM網(wǎng)絡(luò)版 第 9章 弧菌 2023n NMKL 食品中致病性弧菌的檢驗(yàn) 1997n 加拿大 魚和海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的分離計(jì)數(shù) MFLP73 1995n 日本食品衛(wèi)生檢查指征 2023n 選擇性增菌液 堿性蛋白胨水n 選擇性分離培養(yǎng)基 硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖（ TCBS ）瓊脂 改良纖維二糖 多粘菌素 B多粘菌素 E（ mCPC）瓊脂和纖維二糖 多粘菌素 E（ CC）瓊脂平板 ―探針克隆雜交顯示，兩種平板上均有 95％以上的可疑菌落為創(chuàng)傷弧菌n 引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥n 人類感染是因?yàn)槭秤蒙虬肷氖芪廴竞．a(chǎn)品 ,或是因?yàn)閭诮佑|了帶菌的海水或海洋動(dòng)物n 罹患肝病、血色病的個(gè)體易感者及免疫功能低下者 ,一旦感染創(chuàng)傷弧菌 ,更容易發(fā)生致命的傷口感染和原發(fā)性敗血癥 ,后者的病死率超過 50％n 創(chuàng)傷弧菌是美國海產(chǎn)品消費(fèi)引起死亡的首要原因 ,美國州際貝類衛(wèi)生委員會規(guī)定 ,收獲后經(jīng)處理的牡蠣中創(chuàng)傷弧菌限量不超過 30 CFU/g。估計(jì)日本每年創(chuàng)傷弧菌敗血癥病例數(shù)約為 425例。 1 ℃ ， 18 h～ 24 h39℃ ～ 40 ℃ 或 36 ℃177。 1 ℃ ， 12 h～ 16 h樣品 25 g（ mL） +225 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水3％氯化鈉堿性蛋白胨水 3管 3個(gè)合適的稀釋度如果進(jìn)行定性檢測，則不需要進(jìn)行此步驟挑取可疑菌落，接種于 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生化試驗(yàn)或選用 API 20E生化鑒定試劑盒結(jié)果報(bào)告改良纖維二糖 多粘菌素 B多粘菌素 E瓊脂 或 纖維二糖 多粘菌素 E瓊脂 劃線分離篩選試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)，革蘭氏染色，3％氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)樣品制備n 非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 7℃ ～ 10℃ 冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)；冷凍樣品應(yīng)在 45 ℃ 以下不超過 15 min或在 2℃ ～ 5℃ 不超過18 h解凍；如果樣品需要冷凍貯存，應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料），推薦貯存溫度為 70 ℃ 以下。貝類取全部內(nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。 n 以無菌操作取檢樣 25 g（ mL），加入 3％氯化鈉堿性蛋白胨水 225 mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以 8 000 r/min均質(zhì) 1 min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊 2 min，制備成 1:10的均勻稀釋液。增菌n 定性檢測n 將上述 1:10稀釋液于 36 ℃ 177。n 定量檢測n 用滅菌吸管吸取 1:10稀釋液 1 mL，注入含有 9 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，充分混勻，制備 1:100的稀釋液。n 根據(jù)對檢樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三支含有 9 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種 1 mL。1 ℃ 恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng) 12 h～ 16 h。 一支試管劃線一塊平板 。1 ℃ 培養(yǎng) 18 h～ 24 h。純培養(yǎng)n 挑取三個(gè)或以上的可疑菌落，劃線 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板， 36 ℃ 177。初步鑒定n 氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，創(chuàng)傷弧菌為氧化酶陽性。創(chuàng)傷弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀或弧狀。1 ℃ 培養(yǎng) 24 h觀察結(jié)果。n VP試驗(yàn)：以接種針由 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面挑取少許培養(yǎng)物穿刺 3％氯化鈉 MRVP培養(yǎng)基， 36 ℃ 177。沿穿刺線周圍呈擴(kuò)散性生長為動(dòng)力陽性。1 ℃ 培養(yǎng) 24 h，觀察液體混濁情況。確定鑒定n 生化試驗(yàn)：取純培養(yǎng)物分別接種含 3％氯化鈉的賴氨酸培養(yǎng)基， 36 ℃ 177。隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行 ONPG試驗(yàn)。創(chuàng)傷弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng) 目 結(jié) 果革 蘭 氏染色 鏡檢 陰性，棒狀或弧狀氧化 酶 ＋動(dòng) 力 ＋D纖維 二糖 ＋蔗糖 －葡萄糖 ＋分解葡萄糖 產(chǎn) 氣 －乳糖 ＋，或 遲緩 ＋硫化 氫 －賴 氨酸脫 羧 酶 ＋VP －ONPG ＋注：＋陽性；－陰性。如果進(jìn)行定量檢測，根據(jù)證實(shí)為創(chuàng)傷弧菌陽性的試管管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報(bào)告每 g（ mL）創(chuàng)傷弧菌的 MPN值。衛(wèi)生學(xué)概念，包括埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬等的細(xì)菌檢驗(yàn)比較簡單，所以被廣泛用做水源的衛(wèi)生指標(biāo)和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標(biāo)大腸菌群計(jì)數(shù)n 第一法 MPN法n 第二法 平板計(jì)數(shù)法n 第三法 Petrifilm測試片法第一法 MPN法與原 操作步驟不同原方法：初發(fā)酵 → EMB分離培養(yǎng) → 染色，復(fù)發(fā)酵 → 報(bào)告現(xiàn)方法： LST初發(fā)酵 → BGLB驗(yàn)證 → 報(bào)告初發(fā)酵培養(yǎng)基不同n 原方法： 乳糖膽鹽肉湯n 現(xiàn)方法： 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ LST）肉湯LST肉湯 是國際上通用的培養(yǎng)基。 還有就是 LST更容易觀察。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。 檢樣25g(ml)樣品＋ 225ml稀釋液 ,均質(zhì)↓稀釋↓接種 PetrifilmTM大腸菌群測試片↓培養(yǎng)↓ 36?1?C 24h ? 2h 計(jì)數(shù)紅色帶氣泡的菌落↓計(jì)算菌落總數(shù)↓報(bào)告樣品制備按大腸菌群 MPN法的樣品制備方法進(jìn)行。即樣品勻液的 pH值應(yīng)在 ～， pH值過低或過高時(shí)分別用 1M NaOH或 1M HCl予以調(diào)節(jié)。將 PetrifilmTM大腸菌群測試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺面，揭開上層膜，用吸管吸取 1mL樣液垂直滴加在測試片的中央， 將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下 ，把壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。n 將測試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過 20片 ， 36?C 177。 判讀培養(yǎng) 24h ? 2h后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測、用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡、或 P