食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制-wenkub
2023-01-28 22:54:53 本頁(yè)面
【正文】 菌屬，另做補(bǔ)充試驗(yàn)鑒定。在弗勞地氏檸檬酸桿菌群里，氰化鉀和尿素酶也不是 100%陽(yáng)性，而且也偶爾出現(xiàn)賴氨酸陽(yáng)性的菌株。增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)n 國(guó)際上常用的沙門氏菌增菌培養(yǎng)基有 3種，即： (1)亞硒酸鹽增菌液或亞硒酸鹽胱氨酸增菌液， (2)四硫磺酸鹽增菌液或四硫磺酸鹽孔雀綠增菌液， (3)氯化鎂孔雀綠增菌液。n 過(guò)去的理解是 25克食品中不能檢出沙門氏菌，但是沒(méi)有提出要測(cè)定增菌液的靈敏度。沙門氏菌的分類學(xué)地位n 歸于腸桿菌科沙門氏菌屬n 下設(shè) 6個(gè)亞屬： I、 II、 IV、 V、 VI及 III（原亞利桑那菌屬）n 常見的種：雞沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌n 形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)莢膜，無(wú)芽胞，多數(shù)有鞭毛，有動(dòng)力，短小桿菌。n 7) 最終菌落濃度的單位以 “cfu/g (mL)”表示。培養(yǎng) 圓形面積邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù) 。n 將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò) 20片 ， 36?C 177。即樣品勻液的 pH值應(yīng)在 ～， pH值過(guò)低或過(guò)高時(shí)分別用 1M NaOH或 1M HCl予以調(diào)節(jié)。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。衛(wèi)生學(xué)概念，包括埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬等的細(xì)菌檢驗(yàn)比較簡(jiǎn)單，所以被廣泛用做水源的衛(wèi)生指標(biāo)和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標(biāo)大腸菌群計(jì)數(shù)n 第一法 MPN法n 第二法 平板計(jì)數(shù)法n 第三法 Petrifilm測(cè)試片法第一法 MPN法與原 操作步驟不同原方法：初發(fā)酵 → EMB分離培養(yǎng) → 染色，復(fù)發(fā)酵 → 報(bào)告現(xiàn)方法： LST初發(fā)酵 → BGLB驗(yàn)證 → 報(bào)告初發(fā)酵培養(yǎng)基不同n 原方法： 乳糖膽鹽肉湯n 現(xiàn)方法： 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ LST）肉湯LST肉湯 是國(guó)際上通用的培養(yǎng)基。創(chuàng)傷弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng) 目 結(jié) 果革 蘭 氏染色 鏡檢 陰性，棒狀或弧狀氧化 酶 ＋動(dòng) 力 ＋D纖維 二糖 ＋蔗糖 －葡萄糖 ＋分解葡萄糖 產(chǎn) 氣 －乳糖 ＋，或 遲緩 ＋硫化 氫 －賴 氨酸脫 羧 酶 ＋VP －ONPG ＋注：＋陽(yáng)性；－陰性。確定鑒定n 生化試驗(yàn)：取純培養(yǎng)物分別接種含 3％氯化鈉的賴氨酸培養(yǎng)基， 36 ℃ 177。沿穿刺線周圍呈擴(kuò)散性生長(zhǎng)為動(dòng)力陽(yáng)性。1 ℃ 培養(yǎng) 24 h觀察結(jié)果。初步鑒定n 氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，創(chuàng)傷弧菌為氧化酶陽(yáng)性。1 ℃ 培養(yǎng) 18 h～ 24 h。1 ℃ 恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng) 12 h～ 16 h。n 定量檢測(cè)n 用滅菌吸管吸取 1:10稀釋液 1 mL，注入含有 9 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，充分混勻，制備 1:100的稀釋液。 n 以無(wú)菌操作取檢樣 25 g（ mL），加入 3％氯化鈉堿性蛋白胨水 225 mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以 8 000 r/min均質(zhì) 1 min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊 2 min，制備成 1:10的均勻稀釋液。 1 ℃ ， 12 h～ 16 h樣品 25 g（ mL） +225 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水3％氯化鈉堿性蛋白胨水 3管 3個(gè)合適的稀釋度如果進(jìn)行定性檢測(cè)，則不需要進(jìn)行此步驟挑取可疑菌落，接種于 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生化試驗(yàn)或選用 API 20E生化鑒定試劑盒結(jié)果報(bào)告改良纖維二糖 多粘菌素 B多粘菌素 E瓊脂 或 纖維二糖 多粘菌素 E瓊脂 劃線分離篩選試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)，革蘭氏染色，3％氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)樣品制備n 非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 7℃ ～ 10℃ 冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)；冷凍樣品應(yīng)在 45 ℃ 以下不超過(guò) 15 min或在 2℃ ～ 5℃ 不超過(guò)18 h解凍；如果樣品需要冷凍貯存，應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料），推薦貯存溫度為 70 ℃ 以下。估計(jì)日本每年創(chuàng)傷弧菌敗血癥病例數(shù)約為 425例。大陸沿海地區(qū)也時(shí)有創(chuàng)傷弧菌散發(fā)感染的報(bào)告創(chuàng)傷弧菌（ Vibrio vulnificus）n 1976年首次發(fā)現(xiàn)n 引起 傷口感染n 致死性的原發(fā)性敗血癥n 胃腸道感染n 曾稱為乳糖陽(yáng)性弧菌n 革蘭氏陰性嗜鹽菌n 兼性厭氧n 3個(gè)生物型36 ℃177。n 魚類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽中磨碎，然后放在 500 mL的滅菌容器內(nèi)，加 225 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。 n 另取 1 mL滅菌吸管，按上條操作依次制備 10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用 1支 1 mL滅菌吸管。分離n 對(duì)所有顯示生長(zhǎng)的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下 1 cm內(nèi)沾取一環(huán) ，于mCPC或 CC平板上劃線分離。分離平板 ——mCPC 和 CC 典型的創(chuàng)傷弧菌在 mCPC和 CC平板上呈現(xiàn)為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落，直徑 1 mm～ 2 mm。n 涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。創(chuàng)傷弧菌在 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，偶爾斜面變黃。n 嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水， 36 ℃ 177。1 ℃ 培養(yǎng) 24 h～ 48 h后觀察結(jié)果。報(bào)告n 當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表 1要求時(shí)，報(bào)告 25 g（ mL）樣品中檢出創(chuàng)傷弧菌。與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性，LST中的選擇性抑菌劑是月桂基硫酸鹽，相對(duì)于膽鹽穩(wěn)定性更好些。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)紅點(diǎn)周圍有氣泡的菌落為大腸菌群數(shù)。 樣品的接種與培養(yǎng)n 將待檢樣品選取適宜的 2~3個(gè)連續(xù)稀釋度 , 每個(gè)稀釋度接種 2張 測(cè)試片。 1?C培養(yǎng) 24h?2h。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌腸道傳染病沙門氏菌腸道傳染病 人類沙門氏菌病分為兩大類 : 1 、 傷寒與副傷寒 :在世界范圍內(nèi)顯著下降 ,我 國(guó)仍有散在發(fā)生 , 時(shí)有局部暴發(fā)流行 . 2 、 沙門氏菌急性胃腸炎 :在世界 ,在我國(guó)呈 上升趨勢(shì) ,通過(guò)動(dòng)物廣泛分布 ,家禽和豬是 主要的儲(chǔ)存宿主 ,在食品和許多動(dòng)物制品 中發(fā)現(xiàn) ,是傳播的主要原因 . 沙門氏菌食物中毒 引起食物中毒最常見的沙門氏菌：鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌 易引起沙門氏菌中毒的食品：肉、蛋、乳類食品 中毒原因： 食用病畜禽的肉制品食品 病畜禽、帶菌人和動(dòng)物使食品受污染 用不潔凈水外理食品沙門氏菌檢驗(yàn)流程沙門氏菌檢驗(yàn)流程n 前增菌：用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力 。n 培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧，最適溫度 37℃ ， n 營(yíng)養(yǎng)要求：不高，普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好。n 自從 PCR試驗(yàn)技術(shù)推廣應(yīng)用以后，認(rèn)為此項(xiàng)技術(shù)能夠在 n 現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用了 (1)亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，和 (2)四硫磺酸鹽孔雀綠增菌液。沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別沙門氏菌屬和有關(guān)細(xì)菌的鑒別 2n 不過(guò)，沙門氏菌和大腸埃希氏菌的鑒別有一點(diǎn)例外，因?yàn)樵谏抽T氏菌屬內(nèi)有硫化氫陰性的菌株，偶爾也有靛基質(zhì)陽(yáng)性的菌株；在大腸埃希氏菌種內(nèi)，也有少數(shù)靛基質(zhì)陰性的菌株，偶爾也有硫化氫陽(yáng)性的菌株。附表使用說(shuō)明n A1尿素 氰化鉀 賴氨酸 判斷結(jié)果 甲副 + + 沙門氏菌 Ⅳ 和 Ⅴ + + 沙門氏菌個(gè)別變體n A2 甘露醇 山梨醇 判斷結(jié)果 + + 沙門氏菌 靛 + 緩慢愛(ài)德華氏菌 B1 ONPG 沙門氏菌屬 ONPG + 大腸埃希氏菌屬腸桿菌科細(xì)菌生化特性腸桿菌科細(xì)菌生化特性n 近一百年以來(lái)，有許多學(xué)者，為積累腸桿菌科細(xì)菌的生化特性資料，付出了辛勤的勞動(dòng)。該儀器對(duì)細(xì)菌作出的分類鑒定應(yīng)該是按照權(quán)威的細(xì)菌生化特性表作出的。其中對(duì)腸桿菌科細(xì)菌鑒定重要的試驗(yàn)有：氰化鉀、 。n 一般先按照 O抗原分群，然后。n 一是因?yàn)橐蜃友宓男r(jià)不高，難以覆蓋所試驗(yàn)的菌株。n 沙門氏菌抗原的研究已有近一百年的歷史，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)當(dāng)熟悉抗原的相關(guān)理論。大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌 O157:H7/NM檢驗(yàn)檢驗(yàn)一、一、 常規(guī)方法常規(guī)方法n 檢樣n ↓n 25g(mL)+改良 EC肉湯 (m
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