【正文】 抗病毒治療也已近二十年時間，為什么在相同基因型、重要位點(diǎn)變異情況相似的情況下，臨床抗病毒療效差異懸殊，抵抗干擾素治療的機(jī)制也待闡明，我們以往和國外的一些研究工作曾就HBV基因型以及其他位點(diǎn)的基因變異對干擾素抗病毒療效的影響進(jìn)行分析，雖發(fā)現(xiàn)一些可能相關(guān)的原因，但結(jié)果尚不能令人滿意。（2）HBV變異序列特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究目前國內(nèi)外對變異耐藥發(fā)生后為何出現(xiàn)不同臨床結(jié)局缺乏系統(tǒng)的研究，為何同為出現(xiàn)YMDD突變的患者, 一些肝病變加重甚至肝功失代償死亡，而另一些肝功能可完全正常？核苷類似物治療發(fā)生YMDD突變且病情加重者是由于機(jī)體免疫應(yīng)答的不同還是有更重要的HBV突變？初步研究顯示HBV耐藥突變后“表位漂移”及“免疫顯性消長”可能是影響HBV耐藥不同應(yīng)答轉(zhuǎn)歸的重要機(jī)制。4. 乙型肝炎病毒的耐藥機(jī)制（1）核苷類似物對HBV的耐藥規(guī)律及其天然無應(yīng)答性的原因擬對國內(nèi)/國際臨床驗(yàn)證和臨床抗病毒治療的病人系列標(biāo)本，采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序和/或克隆后測序的方法，以及高靈敏度單一基因分子點(diǎn)突變檢測技術(shù)（detection of base substitution on a single molecule，DBSSM），對比治療前和發(fā)生臨床耐藥時DNA序列結(jié)果，尋找與臨床耐藥有關(guān)的變異位點(diǎn)及其規(guī)律。（3）HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的研究運(yùn)用分子生物學(xué)和X射線結(jié)晶學(xué)方法開展與艾滋病藥物相關(guān)的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的研究，在分子水平研究耐藥性形成機(jī)制，研究包括病毒的和與之復(fù)制和變異相關(guān)的細(xì)胞組分和分子間的相互作用及其影響因素。了解耐藥毒株的基因變異特點(diǎn)，確定我國HIV流行株的耐藥株類型，基因型及表型的特點(diǎn)。（2）HIV耐藥機(jī)制研究從測定到的含各類耐藥突變HIV毒株的病人分離病毒，經(jīng)體外藥敏試驗(yàn)確定HIV耐藥突變株基因型與表型間的關(guān)系。3. HIV耐藥性分子流行病調(diào)查和耐藥機(jī)制研究（1）HIV耐藥性的分子流行病學(xué)研究利用已有的全國HIV耐藥性調(diào)查網(wǎng)絡(luò)開展未接受HIV抗病毒治療和治療后人群和治療地區(qū)的耐藥性流行病學(xué)調(diào)查，耐藥毒株出現(xiàn)的情況以及影響因素分析在我國艾滋病高發(fā)區(qū)開展HIV耐藥性的分子流行病學(xué)研究，對接受國家免費(fèi)抗病毒治療人群通過套式PCR擴(kuò)增HIV蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因并進(jìn)行序列測定，將測得序列進(jìn)行分析與國際HIV耐藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和分析,得出治療人群HIV的耐藥突變基本資料，包括其類型、人群分布和發(fā)生發(fā)展規(guī)律。（3）建立符合我國耐藥現(xiàn)狀與國情的快速分子藥敏檢測系統(tǒng)結(jié)核耐藥性的快速鑒定對結(jié)核病的早期診斷、鑒別診斷、個體化的有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。（2）描繪完整的我國結(jié)核病耐藥基因譜，發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制在結(jié)核分子流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上繪制能對我國臨床診斷與防治提供指導(dǎo)意義的耐藥基因譜，對相應(yīng)的耐藥機(jī)制作出研究。2. 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)及耐藥機(jī)制（1）建立先進(jìn)的分子流行病學(xué)方法著重于闡明一線抗結(jié)核藥物和主要二線抗結(jié)核藥物的耐藥株基因突變頻率及中國流行耐藥株突變特點(diǎn)、國內(nèi)主要結(jié)核桿菌耐藥株的優(yōu)勢菌群，耐藥結(jié)核菌群的流行區(qū)域、流行趨勢及范圍，分析耐藥菌群的種類、分布、分子流行病學(xué)特征。采用分子生物學(xué)方法直接從人體體液或相關(guān)標(biāo)本中檢測細(xì)菌的特異性DNA，從而建立快速、準(zhǔn)確的病原菌診斷方法。2）大腸埃希菌等革蘭陰性桿菌CTX－M型ESBLs的傳播機(jī)制及傳播規(guī)律：計(jì)劃在原有基礎(chǔ)上作進(jìn)一步深入的研究，研究CTX－M編碼基因的起源及其傳播規(guī)律，從而有利于耐藥菌的控制。（2）大腸埃希菌耐藥機(jī)制研究1）大腸埃希菌對喹諾酮類的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機(jī)制研究：計(jì)劃對大腸埃希菌對喹諾酮類的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，研究內(nèi)容包括：①質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因qnrA及qnrB分子流行情況，明確質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機(jī)制在喹諾酮類耐藥性形成中的作用。1．細(xì)菌耐藥機(jī)制及耐藥性防治（1）多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制通過對碳青霉烯酶、膜通透性改變及主動外排機(jī)制3方面的較全面的研究，明確多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制。主要研究內(nèi)容：本研究項(xiàng)目包括重要傳染病的5種主要病原體：細(xì)菌、結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒及白色念珠菌。本研究的最終目標(biāo)為阻止或延緩傳染病病原體耐藥性的產(chǎn)生及傳播，有效治療耐藥病原體的感染，提高傳染病的治愈率，增進(jìn)人類健康水平。3. 獲得治療重要傳染病耐藥的新途徑：耐藥病原體感染的治療措施有限、病死率高，通過耐藥真菌新藥靶的篩選及新型藥物的篩選、抗菌藥物防突變濃度研究、抗病毒藥聯(lián)合抗HBV等研究，探尋對付耐藥病原體的新途徑。③HBV耐藥機(jī)制的研究包括HBV對核苷類耐藥規(guī)律、宿主因素對治療效果的影響及HBV新突變株生物學(xué)特性的研究，建立可靠的HBV體外監(jiān)測系統(tǒng)。在上述分子流行病學(xué)及耐藥機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子生物學(xué)信息技術(shù)，直接從臨床標(biāo)本中檢測細(xì)菌及結(jié)核分枝桿菌，同時檢測其耐藥性。2. 系統(tǒng)地了解新耐藥基因或耐藥位點(diǎn)的產(chǎn)生與演變規(guī)律，明確主要耐藥機(jī)制： ①細(xì)菌方面，著重研究近年來新出現(xiàn)的嚴(yán)重的銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥的形成機(jī)制，近年來新發(fā)現(xiàn)的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機(jī)制、ESBL編碼基因的來源及傳播機(jī)制，這些內(nèi)容在國際上均尚未進(jìn)行深入研究。但是病原體流行病學(xué)的傳播規(guī)律因地而異，國外的研究成果不能完全適用于我國，解釋我國的傳染病病原體及其耐藥性的流行情況，更不可能用于指導(dǎo)我國傳染病及其病原體耐藥性的防治工作。項(xiàng)目名稱：人類重要傳染病病原體耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)研究首席科學(xué)家：王明貴 復(fù)旦大學(xué)起止年限：依托部門：教育部29 / 29一、研究內(nèi)容擬解決的科學(xué)問題：鑒于我國在重大傳染病的分子傳播規(guī)律、耐藥產(chǎn)生機(jī)制研究上的滯后，本課題所要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是：建立系統(tǒng)的耐藥病原體分子監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)與完整的反映中國耐藥情況的耐藥基因譜，系統(tǒng)地了解新耐藥基因或耐藥位點(diǎn)的產(chǎn)生與演變規(guī)律，明確主要耐藥機(jī)制，獲得治療重要傳染病耐藥的新途徑。1. 建立系統(tǒng)的耐藥病原體分子監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)與完整的反映中國耐藥情況的耐藥基因譜：分子流行病學(xué)作為一種新的研究方法研究傳染病病原體的傳播規(guī)律，在西方發(fā)達(dá)國家已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并已經(jīng)取得很好的成果。因此，建立我國耐藥菌的分子耐藥監(jiān)測平臺，應(yīng)利用現(xiàn)代分子流行病學(xué)的手段，研究我國耐藥病原體的產(chǎn)生機(jī)制與傳播規(guī)律，在此基礎(chǔ)上建立耐藥傳播的預(yù)警機(jī)制與控制策略。②我國耐藥結(jié)核分枝桿菌新耐藥基因變異位點(diǎn)研究，對新耐藥機(jī)制進(jìn)行深入的研究，指導(dǎo)我國耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的診斷與防治。大大縮短病原體及其耐藥性的病原診斷時間，指導(dǎo)臨床及時、有效地選用藥物。④HIV耐藥基因突變與耐藥特性間的定性和定量關(guān)系，耐藥的生物學(xué)特性，為建立使用高靈敏度、高通量的基因型測定準(zhǔn)確預(yù)測耐藥特性提供依據(jù)，同時對抗HIV靶位－HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)行研究。開展耐藥HIV病毒與相關(guān)細(xì)胞因子并重的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，以側(cè)重病毒分子變異能力以外的機(jī)制包括細(xì)胞靶位的新路線解決HIV耐藥的新途徑。這也是本研究要解決的最根本問題。各病原體的研究內(nèi)容包括耐藥性的分子流行病學(xué)、耐藥性的形成及傳播機(jī)制（包括新耐藥基因的研究）、耐藥菌的快速診斷、耐藥菌感染的預(yù)防與治療新途徑等方面。國內(nèi)近年研究發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌中存在一種能水解亞胺培南但活性又能被氯唑西林抑制的酶（類似于AmpC酶但水解底物輪廓擴(kuò)大包括了碳青霉烯類抗生素），因此極可能存在新的碳青霉烯酶及其它耐藥機(jī)制同時參與，計(jì)劃對具新特性的β內(nèi)酰胺酶進(jìn)行進(jìn)一步的研究，預(yù)期會有新的發(fā)現(xiàn)。②耐藥機(jī)制研究：qnr產(chǎn)物Qnr蛋白對喹諾酮作用靶位的保護(hù)作用、Qnr作用位點(diǎn)和Qnr蛋白的模建及晶體結(jié)構(gòu)的研究，明確耐藥的形成機(jī)制。（3）建立耐藥菌快速基因診斷方法采用分子生物信息學(xué)技術(shù)，研究病原菌的基因組序列或特征性基因序列和耐藥基因序列，目標(biāo)是建立多重DNA引物的反應(yīng)模式，在鑒別革蘭陽性和革蘭陰性菌的主要菌種的同時，測定耐藥譜。（4）建立常用抗菌藥治療各種重要病原菌的“防突變濃度”范圍通過建立體外模型測定常用各類抗菌藥對重要病原菌的防突變濃度（mutantprevention concetration，MPC）和“突變選擇窗”，即建立不同抗菌藥對不同細(xì)菌的防突變濃度范圍及“突變選擇窗”，據(jù)此制訂或調(diào)整抗菌治療方案，達(dá)到提高治愈率，減少耐藥菌產(chǎn)生的目的