【正文】 參考文獻 …………………………………………………………26英文摘要 ……………………………………………………………27致謝 …………………………………………………………………29附：綜 述（一）……………………………………………………31綜 述（二）……………………………………………………39符號說明縮寫 英文全稱 中文譯名ACE angiotensinconverting enzyme 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶AngⅡ angiotensin Ⅱ 血管緊張素ⅡArg arginine 精氨酸β2 AR β2adrenoceptor β2 腎上腺素受體BMI body mass index 體重指數(shù)Bp base pair 堿基對CH cerebral hemorrhage 腦出血DBP diastolic blood pressure 舒張壓dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 三磷酸脫氧核苷EB ethidium bromide 溴化乙錠EDTA ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 EH essential hypertention 原發(fā)性高血壓Gln glutamine 谷酰胺Glu glutamic acid 谷氨酸Gly glycine 甘氨酸 HDL high density lipoprotein 高密度脂蛋白LDL low density lipoprotein 低密度脂蛋白PCR polymerase chain reaction 多聚酶鏈反應RAS rennin angiotensin system 腎素血管緊張素系統(tǒng)Rpm revolutions per minute 轉(zhuǎn)/分鐘SBP systolic blood pressure 收縮壓SNP single nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性TC total cholesterol 總膽固醇TG triglyceriede 甘油三脂TRIs trihydroxymethylaminomethane 三羥甲基氨基甲烷ACE/β2腎上腺素受體基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)聯(lián)研究專業(yè)：內(nèi)科學（心血管病） 研究生：高丙峰 導師：劉興德 教授摘 要 目的：探討ACE基因I/D多態(tài)性和β2AR基因Arg16Gly和Gln27Glu基因多態(tài)性與EH和EH+CH的關(guān)系，旨在從遺傳學角度為EH和EH+CH的防治提供基礎(chǔ)研究資料。方法：選取自2007年1月～2008年6月貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院EH和EH+CH的患者，分為EH和EH+CH兩組。﹚歲；EH+CH組114例，其中男78例，女 36例，平均年齡﹙177。全部患者的診斷符合中國高血壓指南（2005年修訂版）診斷標準（在未服抗高血壓藥的情況下，收縮壓≥140mmHg 和/或舒張壓≥90mmHg）。﹚歲,為我院門診健康體檢者。運用分子生物學方法檢測ACE基因I/D及β2AR Arg16Gly和Gln27Glu基因多態(tài)性。② 與對照組比較，EH 組和EH+CH組的DD基因型和D等位基因頻率均顯著增高，差異有顯著性（P），而EH 組和EH+CH組間的DD基因型和D等位基因頻率無顯著性差異。④ 與對照組比較，EH組和EH+CH組的Gly16Gly基因型和Gly等位基因頻率顯著增高，差異有顯著性（P），而EH 組和EH+CH組間的Gly16Gly基因型和Gly等位基因頻率無顯著性差異。⑥ 與對照組比較，EH 組和EH+CH組的Gln27Gln、Gln27Glu和Glu27Glu基因型和Gln和Glu等位基因頻率相應指標間比較無顯著性差異，EH組和EH+CH組間上述相應指標間比較亦無顯著性差異。②β2AR基因Gly16Gly基因型可能是原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的遺傳易感基因。關(guān)鍵詞：原發(fā)性高血壓；腦出血；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶；β2腎上腺素受體；基因多態(tài)性ACE/β2腎上腺素受體基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)聯(lián)研究專業(yè)：內(nèi)科學（心血管?。? 研究生：任向前 導師：鄭克 教授前 言原發(fā)性血壓是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，它是導致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病的主要因素，患病率和死亡率逐年增高，其腦血管意外是我國原發(fā)性血壓最常見的并發(fā)癥，年發(fā)病率約為120～180/10萬，其中腦出血是臨床神經(jīng)系統(tǒng)常見的急、危、重癥，也是導致人類三大死亡原因之一。而高血壓性腦出血已呈現(xiàn)出越來越明顯的增加趨勢，不斷加劇的患病人數(shù)日益增長與防治措施相對無力之間的矛盾已引起醫(yī)務人員的普遍關(guān)注。由于高血壓是腦出血最危險、最重要的危險因素，控制高血壓對防治腦出血至關(guān)重要[1]。原發(fā)性高血壓是遺傳因素和外界環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，其中遺傳因素的影響占30%～50%。本研究擬探討ACE基因I/D及β2AR Arg16Gly和Gln27Glu 基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)系，進一步研究原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的分子遺傳機制，為原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的防治提供基礎(chǔ)研究資料。腎素血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，其相關(guān)基因也成為重要的高血壓候選基因，其中對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶( angiotensin converting enzyme, ACE)基因插入/缺失（insertion/deletion，I/D）多態(tài)性的研究已成為近年來的熱點之一。材 料 與 方 法1 研究對象 EH組入選患者均來源于貴州地區(qū)無血緣關(guān)系的漢族EH患者78例，其中男53 例，女25例，年齡﹙177。EH的診斷符合中國高血壓指南（2005年修訂版）診斷標準：在未服抗高血壓藥的情況下，收縮壓≥140mmHg和/或舒張壓≥90mmHg。 EH+CH組入選者均來源于貴州地區(qū)無血緣關(guān)系的漢族人，于2007年1月～2008年6月在貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院患者114例，其中男78例，女 36例，平均年齡﹙177。來自我院門診體檢的無血緣關(guān)系的貴州地區(qū)漢族人群共62例，其中男41例，女21例，年齡﹙177。并排除有高血壓、糖尿病、冠心病病史者?；靹蚝蠹觗dH2O定容至100 ml，轉(zhuǎn)至試劑瓶中，105 Pa高壓蒸氣滅菌15min后4℃保存?zhèn)溆?。?）70％乙醇：取無水乙醇70 ml，加ddH2O定容至100 ml，轉(zhuǎn)至試劑瓶中4℃保存?zhèn)溆谩＃?）10%SDS溶液(PH=) 稱取SDS 10 g，溶解于約70 ml ddH2O中，加熱至68℃助溶。（7）引物 100mmol/L 上海捷瑞生物工程有限公司（8）dNTP 10nmol/L 　 天根生化科技（北京）有限公司（9）D2000 DNA Marker 300ul/支 　 天根生化科技（北京）有限公司（10）Taq DNA polymerase 　 天根生化科技（北京）有限公司（11）Tris飽和酚： 　　 上海試劑三廠（12）無水乙醇 　 上海振興化工一廠（13）乙二胺四乙酸（EDTA） 　 Sigma公司（美國）（14）SDS 　　 天根生化科技（北京）有限公司（15）蛋白酶 K 　　　　　　　 10mg/ml 　 天根生化科技（北京）有限公司（16）溴化乙錠（EB）　　　　　10mg/ml 上海試劑三廠（17）氯仿 　 上海振興化工一廠（18）瓊脂糖 　 西班牙進口（19）液體石蠟 　 上海試劑三廠（20）三羥甲基氨基甲烷（Tris） 　 瑞星科技有限公司（21）硼酸 　 上海云嶺化工廠(22)溴酚藍 　 天津市化學試劑一廠3 試驗方法 標本采集：受試者空腹 12h，抽取肘靜脈血2ml,加入到一 2% EDTA抗凝的試管，分離出血漿檢測血脂；白細胞70℃冰凍保存用于提取DNA。 實驗室檢測采用氧化酶法測定包括血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)等指標。 ACE 基因提取、擴增 經(jīng)典微量法分離提取DNA 操作步驟： 2ml EDTA 抗凝冷凍全血于玻璃試管內(nèi)加雙蒸水配平，管蓋頂處標號↓ 4000r/m離心5min↓棄上清，加入ddH2O，上下顛倒混勻，反復洗滌4000r/m離心5min至淡紅色↓最后一次盡量去上清， ～，加雙蒸水至2ml↓4000r/m離心5min↓棄上清，再加ddH2O至2ml重懸白細胞沉淀，上下顛倒混勻↓4000rpm離心5min2↓棄上清（留至250ul～300ul），上下顛倒混勻↓加10%SDS溶液50ul，10mg/ml蛋白酶K液10ul，上下顛倒混勻↓37℃恒溫水浴溫和振蕩或靜止過夜↓次日，白細胞徹底消化（指無可見的沉淀塊）后，取出↓加入等體積飽和酚（約600ul），充分混勻2min↓12000rpm離心5min↓小心吸出上清，轉(zhuǎn)入另一無菌Epp管中，管蓋頂處編號↓300ul飽和酚，300ul氯仿:異戊醇，吸上清500ul，轉(zhuǎn)入另一無菌Epp管中↓加入500ul氯仿:異戊醇，充分混勻2min↓12000rpm離心5min↓ Epp管中分裝，管蓋頂處編號↓加30ul 3mol/L NAAC↓再加入1000ul的無水乙醇，緩慢搖動即可見DNA絲狀物↓12000rpm離心5min↓棄上清，沉淀用1ml 70%乙醇洗滌2，每次8000rpm離心3～5min↓取其中一管用DNA抽干機抽干乙醇或室溫風干沉淀↓用100ul TE溶液溶解DNA沉淀 DNA的鑒定(1)取5 ul完全溶解的DNA加去離子水至500ul，混勻，轉(zhuǎn)移到比色杯中；(2)用紫外分光光度計比色，波長分別置于260nm與280nm,記錄光密度(值), OD260的讀數(shù)用于計算核酸的濃度，OD260與OD280的比值代表DNA的純度；(3)1 OD260值相當于50ug/ml DNA, DNA的含量計算公式為OD26050ug/ml100(稀釋倍數(shù))(4) DNA的純度= OD260/OD280；，表明DNA樣品中含有蛋白質(zhì)，需重新純化；，表明DNA樣品中含有RNA,可用RNA酶進行處理。 PCR 擴增 DNA(1) 引物設(shè)計 參照Volker Herrmann 的研究結(jié)果[2]，并與 GeneBank 核對,ACE基因的擴增：按Rigat方法[3]進行。(2) 25ul PCR 反應體系： PCR反應體積25ul,包含無菌雙蒸水16 ul ,10,25mmol/ ul，,上下游引物﹙10mmol/L﹚ ul，樣本DNA ul，TaqDNA聚合酶﹙﹚ ul。 PCR 擴增產(chǎn)物鑒定電泳分離：取 6ul PCR擴增產(chǎn)物與6，加樣于2％瓊脂糖凝膠（含1ug/ml溴化乙錠），其中第一點樣孔內(nèi)加D2000 ,擴增產(chǎn)物依次加樣后電泳，電壓為160V，電泳時間30min，在紫外線燈下及凝膠成像分析儀（UVP）下鑒定 PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶。在群體中有II、ID及DD三種基因型。根據(jù)條帶，確定各基因型的具體例數(shù)，鑒定ACE基因I/D多態(tài)性。 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)177。s），兩組間等位基因頻率和基因型的比較采用χ2 檢驗，兩組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P。結(jié) 果 1. EH組和EH+CH組的一般情況EH組和EH+CH組的一般情況見表1。s）Tab1 The general information of the patients with EH and EH+CH（177。177。sex(F/M)25/5336/7821/41BMI(Kg/m2)177。177。* 177。DBP (mmHg) 177。*177。177。TG(m mol/L)177。177。177。HDLC (m mol/L)177。177。Age：年齡；Y：歲；sex：性別；F：女性；M：男性；BMI：體重指數(shù)；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDLC：低密度脂蛋白；HDLC：高密度脂蛋白 由表1可見，與對照組比較，EH組和EH合并CH組的血壓顯著增高，差異有顯著性（P），而性別構(gòu)成、年齡、體重指數(shù)、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均無顯著性差異；EH組和EH合并CH組兩組間的上述指標比較亦無顯著性差異。注：1： m