【正文】 響酶切）。平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。參考見(jiàn)解：首先看看平衡酚是否已被氧化？？？有時(shí)由于溶液III配置的問(wèn)題，這會(huì)降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。平時(shí)保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時(shí)，打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。8羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？參考見(jiàn)解：保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。 作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長(zhǎng)速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒(méi)有沉淀？可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積?？赡苜|(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒(méi)有變清，這也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下．可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買(mǎi)試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒(méi)有逐漸由混濁變澄清？提出來(lái)的條帶幾乎沒(méi)有，但是RNA很亮（沒(méi)加RNA酶）？溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒(méi)有由混濁變澄清，參考見(jiàn)解：可能是因?yàn)槿芤簝?chǔ)存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑](méi)有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。菌液不宜生長(zhǎng)太濃，搖床速度不宜過(guò)高。判斷生長(zhǎng)的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線(xiàn)明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？參考見(jiàn)解：很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來(lái)說(shuō)固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)的要好一些。1洗脫時(shí)間過(guò)短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。洗脫效率還取決于pH值。洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí)) ：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。吸附柱過(guò)載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。 菌體中無(wú)質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。】未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？參考見(jiàn)解：大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。肉眼觀察活化菌株。只要平時(shí)做實(shí)驗(yàn)仔細(xì)點(diǎn)就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點(diǎn)刺鼻的氣味，但不至于反感。使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類(lèi)等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。原先測(cè)序鑒定沒(méi)有問(wèn)題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常?參考見(jiàn)解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中。建議涂布棒還是干燒較長(zhǎng)時(shí)間后，冷卻了再涂。質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題解析涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？參考見(jiàn)解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時(shí)殺菌。蘸了酒精后再燒一小會(huì)，燒的是酒精而不是涂布棒。同時(shí)作多個(gè)轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)用幾個(gè)涂布棒免得交叉污染。解決辦法：降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過(guò)高造成的，請(qǐng)大家注意一下！【有兩種方法可以在提質(zhì)粒前判斷菌生長(zhǎng)是否正常：利用你的嗅覺(jué)。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過(guò)去就感覺(jué)到其臭無(wú)比或者沒(méi)有氣味，可以和正常菌液對(duì)照。對(duì)于生長(zhǎng)不正常的菌液進(jìn)行劃板驗(yàn)證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長(zhǎng)情況，LB平板生長(zhǎng)的DH5A正常形態(tài)在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤(rùn)的圓形菌斑，如果觀察到生長(zhǎng)過(guò)快，顏色又是泛黃的話(huà)基本上不正常了。質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。堿裂解不充分：使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長(zhǎng)率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM TrisHCl, 1mM EDTA，)或水。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過(guò)低可能導(dǎo)致洗脫量低。1洗脫體積太?。合疵擉w積對(duì)回收率有一定影響。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。質(zhì)粒抽提過(guò)程很大程度上是受細(xì)菌生長(zhǎng)情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來(lái)的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺(jué)很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒(méi)有質(zhì)粒。達(dá)到OD600 ，（尤其是對(duì)于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡(jiǎn)單的酶切驗(yàn)證根本無(wú)需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過(guò)程仔細(xì)吸取不會(huì)有太多雜志。RNA在菌體中量較多，相對(duì)少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過(guò)程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一