【正文】 D6YWRrWwc^vR9CpbK! zn% Mz849Gx^Gj qv^$UE9wEwZQcUE%amp。 gTXRm 6X4NGpP$vSTTamp。 849Gx^Gj qv^$UE9wEwZQcUE%amp。 gTXRm 6X4NGpP$vSTTamp。MuWFA5uxY7JnD6YWRr Wwc^vR9CpbK! zn%Mz849Gx^Gj qv^$UE9wEwZQcUE%amp。gTXRm 6X4NGpP$vSTTamp。MuWFA5ux^Gj qv^$UE9wEwZQcUE% amp。gTXRm 6X4NGpP$vSTTamp。MuWFA5uxY7JnD6YWRr Wwc^vR9CpbK!zn%Mz849Gx^Gj qv^$UE9wEwZQcUE% amp。 gTXRm 6X4NGpP$vSTTamp。849Gx^Gj qv^$UE9wEwZQcUE%amp。 QA9wkxFyeQ^! djsXuyUP2kNXpRWXm Aamp。 參考文獻(xiàn)： 1． 葉應(yīng)嫵；王毓三；申子瑜全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程 2021 2． 趙玉柱 ；斐林試劑與雙縮脲試劑的比較 [期刊論文 ] 生物學(xué)通報(bào) 內(nèi)部資料 請(qǐng)勿外傳 9JWKf wvGt YM*Jgamp。在線性范圍測(cè)定試驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得 R2=， R2偏小，但 10名同學(xué)測(cè)得劑量反應(yīng)曲線的 R2值比較，有 7名同學(xué)測(cè)得的數(shù)據(jù) R2大于 ，所以 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的線性關(guān)系還是比較好的。在回收試驗(yàn)中， 一般要求回收率在 95%~105%，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的平均回收率為 %105%， 10名同學(xué) 平均回收率中有 5名同學(xué)的平均回收率在 9 95%~105%之間，另五名同學(xué)的平均回收率在 95%~105%之外，說(shuō)明①本人的所測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確度不高；② 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的準(zhǔn)確度也不太高。 表 11 10名同學(xué)測(cè)得劑量反應(yīng)曲線的 R2值 6. 總結(jié)討論 本文介紹雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)，經(jīng)過(guò)配制雙縮脲試劑，并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、線性范圍測(cè)定。 結(jié)果 結(jié)果記錄 表 10 蛋白樣品吸光度測(cè)定結(jié)果 蛋白濃度 吸光度 蛋白濃度 吸光度 8 1g/l 75g/l 5g/l 100g/l 25g/l 125g/l 50g/l 150g/l 繪制劑量反應(yīng)曲線 以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以各樣品吸光度為縱坐標(biāo)作圖， EXCEL繪制吸光度 蛋白濃度曲線，同時(shí)計(jì)算線性關(guān)系方程及相關(guān)系數(shù)。 試劑和儀器 150 g/L 蛋白溶液；雙縮脲試劑；蒸餾水；分光光度計(jì)；水浴箱 實(shí)驗(yàn)操作 樣品制備 （樣品 28用樣品 1加相應(yīng)體積蒸餾水配制） 檢測(cè)樣品 1： 150 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 2 ： 125 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 3 ： 100 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 4 ： 75 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 5 ： 50 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 6 ： 25 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 7 ： 5 g/L 蛋白溶液 檢測(cè)樣品 8 ： 1 g/L 蛋白溶液 加樣和測(cè)定 表 9 加樣 試劑 (mL) 空白管 樣品管 蒸餾水 — 樣品 — 雙縮脲試劑 3 3 注：空白管做一管， 8個(gè)樣品每個(gè)做 1管，共計(jì) 1+8=9管。距離理想的準(zhǔn)確度有點(diǎn)距離。 渦旋混勻后， 37℃ 水浴 10分鐘，在波長(zhǎng) 540nm條件下比色，空白管調(diào)零，用分 光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙縮脲法測(cè)定蒸餾水中加入的蛋白質(zhì)的回收率，判斷雙縮脲法比例系統(tǒng)誤差的大小，從而評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。 表 3 10位同學(xué) 結(jié)果的比較 均值 標(biāo)準(zhǔn)差 s 變異系數(shù) CV% 本人 同學(xué) 1 同學(xué) 2 同學(xué) 3 同學(xué) 4 同學(xué) 5 同學(xué) 6 同學(xué) 7 同學(xué) 8 同學(xué) 9 4. 回收試驗(yàn) 回收試驗(yàn)原理 5 回收試驗(yàn)是反映分析方法準(zhǔn)確測(cè)定加入樣品中已知濃度或量的純分析物能力的試驗(yàn)，是評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確度的有效方法。 ④所使用的比色杯經(jīng)過(guò)多次使用，比色杯壁里遺留一些有色物質(zhì)，影響了測(cè)量結(jié)果。 ②使用的加樣槍很多都老化了，不好用，導(dǎo)致封密性不強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)誤差大。 結(jié)果 結(jié)果記錄 表 2 20個(gè)測(cè)定管的吸光度值 試管號(hào) 吸光度 試管號(hào) 吸光度 試管號(hào) 吸光度 試管號(hào) 吸光度 1 6 11 16 2 7 12 17 3 8 13 18 4 9 14 19 5 10 15 20 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果處理 4 計(jì)算公式標(biāo)準(zhǔn)差 ? ???? )1()( 2 nxxs ，變異系數(shù) 100)(% ??? xsCV 標(biāo)準(zhǔn)差 s=，變異系數(shù) CV%= 討論評(píng)價(jià) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)的 CV%=， CV%值比較大，超過(guò) ，說(shuō)明測(cè)定的精密 度比較低。 表 1 試劑添加 加人物 (ml) 試劑空白管 測(cè)定管 20 蒸餾水 — 待測(cè)樣品 — 雙縮脲試劑 3 3 渦旋混勻后， 37℃ 水浴 10分鐘，在波長(zhǎng) 540nm條件下比色，空白管調(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度。這兩種不同加試劑順序的配制方法，雖然過(guò)程不同，過(guò)程中顏色變化也不同，但最后的結(jié)果是相同的。 通常加入碘化鉀 可以防止銅離子自動(dòng)還原形成一價(jià)氧化銅沉淀。配好的雙縮脲試劑應(yīng)貯存于塑料瓶中 (或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中 )。 2. 雙縮脲的配制 稱取 6g NaOH溶于新鮮制備的 25 ml蒸餾水中，配成 6mol/L氫氧化鈉溶液。 1. 儀器與試劑 儀器 721型分光光度計(jì)；水浴箱。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。但請(qǐng)注意：凡含有 2個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)或含有 1個(gè)肽鍵和 1個(gè)一 CS— NH一CH2一 NH一 CH20H、一 CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)，以及乙二酰乙二胺都有此顏色反應(yīng)。 蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此，也能在堿性環(huán)境中與 二價(jià)銅離子 結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與二價(jià)銅離子形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。本文介紹雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)學(xué)生練習(xí)和掌握方法學(xué)評(píng)價(jià)有重要意義?！度珖?guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦 Doumas雙縮脲配方作為血清總蛋白測(cè)定的常規(guī)方法 [1]。 結(jié)論 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的性能不高，本人測(cè)得的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù) CV%偏大，回收率偏高，線性范圍一般，或許這是個(gè)人操作因數(shù)，因?yàn)檫€有其他同學(xué)的結(jié)果比較好的。 結(jié)果 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV%為 ，回收試驗(yàn)平均回收率為 %，線性范圍測(cè)定的 R178。 1 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià) 摘要：目的 評(píng)價(jià)雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法性能。 方法 配制雙縮脲試劑，并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、線性范圍測(cè)定。 為 。 關(guān)鍵詞： 雙 縮脲 法；血清總蛋白；方法學(xué)評(píng)價(jià) 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白至今已經(jīng)有近 100年的歷史，其間該方法也得到不斷改進(jìn)，是目前測(cè)定血清總蛋白的常用方法之一。方法學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生日后在工作中評(píng)價(jià)檢驗(yàn)方法非常重要，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生邏輯思維和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制具有重要作用。 雙縮脲試劑鑒定蛋白質(zhì)的原理： 雙縮脲（ NH2CONHCONH2）是兩個(gè)分子脲經(jīng) 180℃ 左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。此反應(yīng)不需要加熱，被用來(lái)定性鑒定蛋白質(zhì)。 因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽均有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽 [2]。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、 Tris 2 緩沖液和某些氨基酸等。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差，不適合微量蛋白的測(cè)定 。 試劑 牛血清白蛋白；硫酸銅結(jié)晶 (CuSO4?5H2O)； 酒石酸鉀鈉 (NaKC4H4O6?4H2O)；氫氧化鈉 (NaOH)；碘化鉀 (KI)；蒸餾水。 稱取 g硫酸銅， g酒石酸鉀鈉， g碘化鉀依次溶解于 125 ml蒸餾水中．在攪拌下加人 6mol/L氫氧化鈉溶液 25 ml，用蒸餾水定容至 250 ml。此試劑可長(zhǎng)期保存，若瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)則衙重配。在配制雙縮脲試劑過(guò)程中，進(jìn)行兩種不同加試劑順序，如下 順序 1：硫酸銅→酒石酸鉀鈉→碘化鉀→氫氧化鈉 順序 2：硫酸銅→碘化鉀→酒石酸鉀鈉→氫氧化鈉 這兩種順序的區(qū)別是加酒石酸鉀鈉和加碘化鉀的順序不同，“順序 1”在加完酒石酸鉀鈉后溶液是青藍(lán)色的 (如圖 1左 )，“順序 2”在加完碘化鉀后溶液顏色是褐色的 (如圖 1右 )，但兩種順序在加完所有試劑后，顏色都是相同的，都為深藍(lán)色，如圖 2。 3 圖 1 (左為先加酒石酸鉀鈉 ) 圖 2 (左為先加酒石酸鉀鈉 ) 3. 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 材料 待測(cè)樣品、雙縮脲試劑、蒸餾水、 721型分光光度計(jì)、水浴箱 方法 取 21支試管放試管架，分別標(biāo)記空白管 1支，重復(fù)測(cè)定管 20支，按表 1添加試劑。 計(jì)算待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差 S和變異系數(shù) CV%值。原因可能有以下幾點(diǎn)： ①實(shí)驗(yàn)中使用的分光光度計(jì)比較老舊，一直性能不穩(wěn)定，多位同學(xué)使用后都表示結(jié)果不太好。 ③個(gè)人加樣誤差，在一些關(guān)鍵試劑上加樣可能有誤差。 通過(guò) 10位同學(xué)結(jié)果的比較，如表 3，有五位同學(xué)的結(jié)果小于 4，另五個(gè)同學(xué)的結(jié)果大于 4，最大的 CV值是本人測(cè)得，說(shuō)明本人的結(jié)果比較差， 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的精密度不算太好?；厥赵囼?yàn)可有效反映方法的比例系統(tǒng)誤差，也可反映方法的競(jìng)爭(zhēng)性干擾。 回收樣品制備 表 4 基礎(chǔ)樣品 回收樣品 1 回收樣品 2 回收樣品 3 待測(cè)樣品 150g/l 蛋白 — 蒸餾水 — 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的加樣，如表 5 表 5 試劑 (mL) 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 樣品管 蒸餾水 — — 150g/l 蛋白溶液 — — 樣品 — — 雙縮脲試劑 3 3 3 注：空白管和樣品管各做一管，樣品管每個(gè)樣品做 2管取平均值，共計(jì)1+1+2+2+2+2=10管。 結(jié)果 結(jié)果記錄 表 6 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的吸光度值 標(biāo)準(zhǔn)管 基礎(chǔ)管 樣品管 1 樣品管 2 樣品管 3 吸光度 平均值 結(jié)果計(jì)算 6 加入濃度 (g/L)=150 (回收樣品中加入的 150g/L蛋白溶液體積 /) 回收濃度 =回收樣品測(cè)得能濃度 — 基礎(chǔ)樣品測(cè)得濃度 回收率 =(回收濃度 /加 入濃度 ) 100% 表 7 樣品回收 回收樣品 1 回收樣品 2 回收樣品 3 加入濃度 (g/L) 25 50 75 回收濃度 (g/L) 回收率 平均回收率 標(biāo)準(zhǔn)偏差 CV% 回收試驗(yàn)評(píng)價(jià) 一般要求回收率在 95%~105%，最為理想的回收率為 100%，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的平均回收率為 %105%，根據(jù) 10名同學(xué)平均回收率的比較 (如表 8，圖 3是 10名同學(xué)平均回收率的散點(diǎn)圖），有 5名同學(xué) 的平均回收率在 95%~105%之間，另五名同學(xué)的平均回收率不在 95%~105%之間，說(shuō)明①本人的所測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確度不高；② 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的準(zhǔn)確度也不太高。 表 8 10名同學(xué)樣品回收結(jié)果比較 平均回收率 標(biāo)準(zhǔn)偏差 CV% 圖 3 10名同學(xué)平均回收率的散點(diǎn)圖 5. 線性范圍評(píng)價(jià)試驗(yàn) 7 線性范圍原理 使用不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定各自的吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算雙縮脲法的線性關(guān)系方程及相關(guān)系數(shù)。 混勻后 37℃水浴 10分鐘或室溫放置 30分鐘， 540nm波長(zhǎng)比色，空白管調(diào)零。 圖 4 劑量反應(yīng)曲線 線性評(píng)價(jià) 從劑量反應(yīng)曲線結(jié)果來(lái)看， R2=， R2偏小，這組數(shù)據(jù)的線性范圍偏差一些，但 10名同學(xué)測(cè)得劑量反應(yīng)曲線的 R2值比較，有 7名同學(xué)測(cè)得的數(shù)據(jù) R2大于，所以 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的線性關(guān)系還是比較好的。在批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，變異系數(shù) CV%為 ，比較大， 10位同學(xué)結(jié)果中，有五位同學(xué)的結(jié)果小于 4，另五個(gè)同學(xué)的結(jié)果大于 4， 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的精密度不算太好。距離理想的準(zhǔn)確度有點(diǎn)距離。 如果能排除個(gè)人操作誤差的因素， 雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的精密度和準(zhǔn)確度都不太高，線性關(guān)系算好， 總的來(lái)說(shuō)， 雙縮脲 法測(cè)定血清總蛋白的方法性能不太高。 6a*CZ7H$dq8Kqqf HVZFedswSyXTyamp。 UE9aQGn8xp$Ramp。 qYpEh5pDx2zVkumamp。ksv*3t nGK8!z89Am YWpazadNuKNamp。 q