微生物學(xué)實驗[最終定稿]-文庫吧資料
2024-10-29 04:07本頁面
【正文】 認真的科學(xué)態(tài)度理解與驗證基本原理掌握并不斷提高分析和解決問題的方法啟迪創(chuàng)新思維二、具體要求實驗前510分鐘到達實驗室。(五)實驗報告1．結(jié)果(1)將測定的OD600值填入下表：培養(yǎng)時間對照 0 3 4 6 8 10 12 14 16 20光密度值OD600(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。該方法準確度高、操作簡便。測定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測定，對細胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，~(測定OD值前，將待測定的培養(yǎng)液振蕩，使細胞均勻分布)。3．培養(yǎng)將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1116和20h，將標(biāo)有相應(yīng)時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。圖15—6 直接用試管測OD值(四)操作步驟1．標(biāo)記取11支無菌大試管，用記號筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時間，即0、1116和20h。圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶(三)器材1．菌種 大腸桿菌2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時間(橫坐標(biāo))取樣測定，以測得的klett units為縱坐標(biāo)，便可很方便地繪制出細菌的生長曲線。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養(yǎng)時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長具有重要意義。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。(二)基本原理大多數(shù)細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次。（五）實驗報告l．結(jié)果每毫升樣品原液菌數(shù)=從標(biāo)準曲線查得每毫升的菌數(shù)稀釋倍數(shù)2．思考題(1)光電比濁計數(shù)的原理是什么?這種計數(shù)法有何優(yōu)缺點?(2)光電比濁計數(shù)在生產(chǎn)實踐中有何應(yīng)用價值?(3)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?四 大腸桿菌生長曲線的測定(一)目的要求1．通過細菌數(shù)量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長線。各種操作條件必須與制作標(biāo)準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數(shù)就不準確。2．樣品測定將待測樣品用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。（2）調(diào)整菌液濃度 用血細胞計數(shù)板計數(shù)培養(yǎng)24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升110210410610810101012106含菌數(shù)的細胞懸液。圖15—4 比濁法測定細胞濃度的原理（三）器材1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗來確定。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。本實驗采用血細胞計數(shù)板計數(shù)。然后，以樣品液所測得的光密度，從標(biāo)準曲線中查出對應(yīng)的菌數(shù)。在一定的范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖154)。2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。五、實驗報告1．結(jié)果2．將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表稀釋度104105106Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均每毫升中的cfu2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計數(shù)準確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點及應(yīng)用。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當(dāng)吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。由1010106三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。同一稀釋度的三個重復(fù)對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗不精確。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。圖15—3平板菌落計數(shù)操作步驟4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中。放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。將多余的菌液放回原菌液中。依次標(biāo)是1010101010106。（四）操作步驟l．編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標(biāo)明10
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