植物組織培養(yǎng)-文庫吧資料
2025-01-20 04:56本頁面
【正文】 ／分的降溫速度從 0℃ 降到 10℃ ，輕輕搖動試管，使試管內的溶液結冰。 (2)將盛有材料的試管 插入冰浴中 ， 待溫度平衡后， 加入0℃ 預冷的冰凍保護劑 (10％ DMSO + mo1／ L 山梨糖醇 )，使保護劑稍淹過保存材料。保存后的材料表現(xiàn)出較高的存活率。 6)抗逆性的分析。 4)同工酶譜的分析。 2)后代的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。存在停滯期。 2. 2．顯示細胞存活率的二醋酸酯熒光素 (FDA)染色法，反映酯酶的脫脂化作用，或采用中性紅染色法。 6．光照對恢復生長的影響 黑暗條件下有利于超低溫保存培養(yǎng)物的恢復生長。因為超低溫冰凍材料化凍時，再次結冰的危險溫度區(qū)域大約是 —50℃ 至 — 10℃ 。 因此要使植物種質的超低溫保存獲得成功，不僅要求有一個合適的降溫冰凍程序，而且還要求采取合適的化凍方法，以避免在化凍過程中產生細胞內的次生結冰，并應防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的破壞。保存材料經冰凍保護劑在 0℃ 預處理后，逐步通過這些溫度，樣品在每級溫度 上停留一定時間 (4— 6分鐘 )，然后浸入液氮。 第一步是用慢速降溫法從 0℃ 降到一定的預凍溫度，使細胞達到適當?shù)谋Ｗo性脫水； 第二步，投入液氮中迅速冰凍。在這種降溫速度下，可以使細胞內的水分有充足的時間不斷流到細胞外結冰，從而使細胞內的水分減少到最低限度，達到良好的脫水效應，避免細胞內結冰。 以每分鐘 0. 110℃ 的降溫速度 (一般 1— 2℃ ／分較好 )。 (2)慢速冰凍法：通常成熟的植物細胞都具有大的液泡，含有大量水分。 植物體內的水分在降溫冰凍過程中， 從 10℃ 到 140℃ 是冰晶形成和增長的危險溫度區(qū)， 在 140℃ 以下，冰晶不再增生。 4．降溫冰凍方法 (1) 快速冰凍法：將材料從 0℃ ，或者其他預處理溫度 (如木本植物的冬芽在 3℃ 一 10℃ 預處理 20天 )直接投入液氮。 但作為冰凍保護劑的物質應該具備以下特性： （ 1）易溶于水； （ 2）在適當濃度下對細胞無毒； （ 3） 化凍后容易從組織細胞中去除。 3．冰凍保護劑 迄今，已經報道了多種類型的冰凍保護劑。 (2)預培養(yǎng)，增加培養(yǎng)基中的糖濃度，提高滲透壓；或在預培養(yǎng)基中加入誘導抗寒力的物質或冰凍保護劑，如脫落酸 (ABA)，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亞砜 (DMSO)等。 2．預處理 目的： A. 增加細胞分裂和同步化； B. 減少細胞內自由水的含量； C. 增強細胞的抗寒性。 (9) 遺傳性狀的分析：如植株的形態(tài)特征、生長發(fā)育狀況、染色體、同工酶及抗逆性等。如果是單細胞或原生質體，可采用活性熒光素染色法，顯示活細胞，統(tǒng)計存活率。 (6) 保存后的化凍：一般在 37— 40 ℃ 溫水浴中快速化凍。 (4) 加入 0℃ 預冷的冰保護劑，在 0℃ (冰浴中 )放置30一 45分鐘。 (2) 預處理。 (7) 光學顯微鏡和紫外熒光顯微鏡； (8) 分光光度計。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。 在復蘇時，一般以很快的速度升溫， 12分鐘內即恢復到常溫，細胞內外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質損傷產生 ，凍存的細胞經復蘇后仍保持其正常的結構和功能。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。這種因保存溶液中溶質濃度升高而導致的細胞損傷稱為 溶質損傷或稱溶液損傷。
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