基因工程技術(shù)概述-文庫吧資料
2025-01-12 09:23本頁面
【正文】 菌落，小抽質(zhì)粒，電泳 菌落 PCR 94 ℃ 10 min 94 ℃ 30s 55 ℃ 40s 72 ℃ 1min 73 72 ℃ 8min 74 4 ℃ hold X 30 堿裂解法 堿裂解法 ? 原理： pH值介于 ，線形的 DNA和環(huán)狀的質(zhì)粒DNA變性，中間的氫鍵短裂，線狀 DNA變性后互相分開，而環(huán)狀分子雙螺旋主鏈骨架彼此盤繞，互補兩條鏈緊密合在一起。 ? 氯化鈣法 ： ? 氯化鎂法： ? 電轉(zhuǎn)法： 氯化鈣 法： 原理 快速生長的細菌用低滲低濃 度(50 ~ 100mM) 的氯化鈣（ CaCl2)處理，使細胞腫脹成球形 加入質(zhì)粒后，即于細胞表面形成抗 DNAase的羥基 磷酸鈣復(fù)合物 經(jīng) 42℃ 熱休克后，復(fù)合物被細胞吸收。 ? 轉(zhuǎn)化效率： 只有很少比例的細胞有能力摻入質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化時大約在 1000個 DNA分子中，只有一個 DNA分子獲得成功。 ? 感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過感染受體細胞，然后整合到受體細胞基因組上。 ? 受體細胞的要求：必須具備使外源 DNA進行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細胞的選擇與鑒定。 CIP的比活性比 BAP高出 10倍以上，而且對熱敏感，便于加熱使其失活。 堿性磷酸酶 根據(jù) DNA重組的需要，為防止兩 DNA片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使 DNA末端的 5′ P成為 5′ OH。 其他酶：末端修飾酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase） 簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。而且只能連接粘性末端。也可做 DNA修復(fù)。 14℃ (不高于 16℃ )過夜 連接酶：兩種 ? DNA連接酶： 連接雙鏈中兩條 DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。 DNA的純度 , 載體與目的基因的比例 。四環(huán)素失活 （ 4）目的基因片段： Bgl II SalI，載體： BamH I SalI 反向，不能進行表達。Sal I) 其他方法： Bgl II AGATCT TCTAGA BamH I GGATCC CCTAGG A GATCT TCTAG A G GATCC CCTAG G 連接 策略 ： 選擇連接位點： （ 1） HindIII粘性末端 載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活 ,方向不確定。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 加同聚物尾： 載體與片段沒有共同的粘性末端時，可直接通過末端轉(zhuǎn)移酶分別接上 poly（ dA）和 poly（ dT），然后退火，直接轉(zhuǎn)化，分子間空缺部分可以在宿主體內(nèi)修復(fù)。 堿性磷酸酶處理： 平頭末端： （ 1）增加連接酶的量 （連接酶對平末端 DNA的 Km 約高于粘性末端 DNA100倍 （ 2）在末端加上一個人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi)切酶位點，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體連接。 用 堿性磷酸酶 (能除掉 DNA5`端 P基團 ， 使 5`端帶一 OH)處理載體 ， 可防止載體自 環(huán)化 。 pFLAGCMV系列 (Sigma) TetOn/TetOff Expression Systems TetOff pTetsplice(pTetPTEN) pTetTAK PSVneo
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