基因工程技術(shù)概述-展示頁
2025-01-14 09:23本頁面
【正文】 DNA分子的體外連接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配對進(jìn)行連接 兩種情況： （ a） 目的基因和載體 用 同一種限制酶切割 后連接 。 TA 克隆 A A TOPOTA ? 原核 Histag: pQE系列 (Qiagen), pET22(Novagen) GSTtag: pGEX系列 (Pharmacia) ?表達(dá)載體： 帶有調(diào)控基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟 動子等，這些調(diào)控元件應(yīng)與宿主細(xì)胞相適應(yīng)。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導(dǎo)致抗性基因 插入失活 ，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。 ? 有兩個(gè)抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。 是細(xì)菌染色體外能夠自我復(fù) 制的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。大多是一些抗菌素抗性基因，賦予受體細(xì)胞對某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。 ? 具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個(gè) 松弛型 的質(zhì)粒。主要用 于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移?？蓪⒅亟M體 DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（ pCDNA3）。主要由細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的 DNA重組構(gòu)建（ PBR322）。 ? 種類： 按來源分： 質(zhì)粒載體 (plasmid vector)、噬菌體載體 (phage vector)、 柯氏質(zhì)粒載體 (cosmid vector)、病毒載體 (virus vector ). 按作用分： 克隆載體 (cloning vector )、表達(dá)載體 (expression vector)、穿梭載體 (shuttle vector) ? 克隆載體 (cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的 基因擴(kuò)增 的載體。 高保真聚合酶： HF, Pfu, Probest 等。 ? 加上想要的標(biāo)簽，如 Flag, Myc, His, HA。 ? 轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞，研究其功能，表達(dá)調(diào)控機(jī)制等 基因工程基本 步驟 ： 分、切 目的基因 + 載體分子 轉(zhuǎn) 導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化） 接 構(gòu)成重組 DNA分子 篩 篩選含有重組分子的克隆 鑒 鑒定重組分子片段 基因工程流程示意圖 構(gòu)建重組分子（連接） ? 原料 ： 目的基因：研究對象 載體： 目的基因的運(yùn)載工具 工具酶： 連接酶、限制性內(nèi)切酶 目的基因片段 來源 ： ? 基因組 DNA ? PCR 方法擴(kuò)增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表達(dá)或克隆構(gòu)建或從商品化的 cDNA文庫擴(kuò)增） ? 通過 RTPCR 方法得到目的基因 cDNA ? 人工合成基因片段（價(jià)錢昂貴） 目的基因 來源選擇 ： ? 取決于解決什么問題？ 基因功能研究 cDNA RTPCR 基因表達(dá)調(diào)控的研究 基因組 DNA PCR PCR： ? 引入合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè) /兩個(gè)。 應(yīng)用： ? 克隆感興趣基因進(jìn)行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。基因工程技術(shù) Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first rebinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of b
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