生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)-文庫(kù)吧資料
2024-10-13 16:05本頁(yè)面
【正文】 蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 B. 化學(xué)法 ：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵 。羧肽酶 A能水解除 Pro,Arg和 Lys以外的所有 C末端氨基酸殘基； B只能水解Arg和 Lys為 C末端殘基的肽鍵。根基不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的 C末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為 N末端的肽鍵速度最大。 H 2 N C H CR OH N C H CR O OR nCC HH N O Hn 1N 端氨基酸 C 端氨基酸OR nCC HH 2 N O HH 2 N C H CR ON H N H 2 +H+N H 2 N H 2氨基酸酰肼 C 端氨基酸 D. 氨肽酶法： 氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的 N端逐個(gè)的向里水解。多肽與肼在無水條件下加熱， C端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰 氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到 1?109mol。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是 N端氨基酸分析法?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。 ③二硫鍵的斷裂： 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。 (2)測(cè)定步驟 ① 多肽鏈的拆分： 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。 (1) 測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求 A. （ 97%以上）； B. ； C. ； D. ；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。 的測(cè)定 蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。 NHCOC H 2 N H COC H N H COC H3C HC HO HC H2O HC HH N C N H C H C N H C H 2 CC OC HNHH OC H 2 N HN HC H C HC H 3C H 2 C H 3C OOOOC H 2C H2SOO H鵝 膏 覃 堿 的 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) +H3NTyrGlyGlyPheMetCOO +H3NTyrGlyGlyPheLeuCOO Met腦啡肽 Leu腦啡肽 C y sT y rI L eG l nA s nC y sP r oL e uG l y N H2SS牛 催 產(chǎn) 素C y sT y rG l nA s nC y sP r oSSP h eA r gG l y N H2牛 加 壓 素 二 .蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1. 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) (Primary structure)包括： (1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目 . (2)多肽鏈的氨基酸順序， (3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。 ?在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。 ?肽鍵中的 CN鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。如上述五肽可表示為： SerValTyrAspGln C C N C C N C C N C C N CC H 2 C H C H 2 C H 2 C H 2C O OO H C O 2 H C H 2C O N H 2O HC H 3H 3 N+O O O OH H H H HH H H HS e r V a l T y r A sp G l nC H 3N 端 C 端肽鍵 ?肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。 ? 在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序 ? 通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的 ?氨基，稱為氨基端或 N端；在另一端含有一個(gè)游離的 ?羧基，稱為羧基端或 C端。 ?由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。 ?蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在 6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。 N C S N H C H COR 2N C H COR 1HHNHS :CC H COR 1H N N H C H COR 2SNHCN H OCR 1C HN H 2 C H COR 2NCO C HN HSCR 1 ? 肽鏈（ N端氨基酸）與 PITC偶聯(lián)，生成 PTC肽 ? 環(huán)化斷裂：最靠近 PTC基的肽鍵斷裂，生成 PTC氨基酸和少 ? 一殘基的肽鏈，同時(shí) PTC氨基酸環(huán)化生成 PTH氨基酸 ? 分離 PTH氨基酸 ? 層析法鑒定 ? Edman降解法的改進(jìn)方法 DNSEdman降解法 ? 用 DNS(二甲基萘磺酰氯 )測(cè)定 N端氨基酸 ? 原理 DNFB法相同 ? 但水解后的 DNS氨基酸不需分離，可直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定 ? 由于 DNS有強(qiáng)烈熒光，靈敏度比 DNFB法高 100倍，比 Edman法高幾到十幾倍 ? 可用于微量氨基酸的定量 ? 用 Edman降解法提供逐次減少一個(gè)殘基的肽鏈 ? 靈敏度提高，能連續(xù)測(cè)定。 (3) 與 2,4二硝基氟苯（ DNFB）反應(yīng) ? 反應(yīng)特點(diǎn) α NH2的反應(yīng) α NH2的一個(gè) H原子可被烴基取代 (鹵代烴 ) ，與 DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基苯氨基酸 ? 應(yīng)用：鑒定多肽或蛋白質(zhì)的 N末端氨基酸 ε NH酚羥基也能與 DNFB反應(yīng)，但其生成物，容易與α DNP氨基酸區(qū)分和分離 ★ 首先由 Sanger應(yīng)用，確定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu) A. DNP肽，得 DNPN端氨基酸及其他游離氨基酸 DNP氨基酸 D. ? 由 Edman于 1950年首先提出 ? 為 α NH2的反應(yīng) ? 用于 N末端分析，又稱 Edman降解法 肽分子與 DNFB反應(yīng)，得 DNP肽 層析法定性 DNP氨基酸，得出 N端氨基酸的種類、數(shù)目 (4)與異硫氰酸苯酯（ PITC）的反應(yīng) ? Edman （ 苯異硫氰酸酯法） 氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種 N端分析法。 ，滴定終點(diǎn)在 9左右，可用酚酞作指示劑。 (2)與甲醛反應(yīng) ? 反應(yīng)特點(diǎn) α NH2的反應(yīng) ，中性條件，甲醛與 α NH2很快反應(yīng)，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。 ★ ★ ★ ? 反應(yīng)要點(diǎn) NH2與 COOH共同參與 ，可在 570nm測(cè)定吸光值 D. 測(cè)定范圍： ~50181。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。 側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的 pK’1和 pK’2的算術(shù)平均值： pI = (pK’1 + pK’2 )/2 同樣，對(duì)于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其 pI值也決定于兩性離子兩邊的 pK’值的算術(shù)平均值。這一 pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡(jiǎn)稱 pI。+H+H+C O O C HH 3 N +R H+H++pK239。 在兩性離子中 ， 氨基是以質(zhì)子化 (NH3+)形式存在 ，羧基是以離解狀態(tài) (COO)存在 。 ? 色氨酸的 ?max＝ 280nm，?280=。 ? 酪氨酸的 ?max＝ 275nm，?275=。 (5)光吸收： 構(gòu)成蛋白質(zhì)的 20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū) (220nm)均有光吸收。 (3) 味感： 其味隨不同氨基酸有所不同，有的
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