細(xì)胞工程第五章ppt課件-文庫吧資料
2024-09-24 20:17本頁面
【正文】 如注射到人體內(nèi)引起 人抗鼠反應(yīng) 、 過敏反應(yīng) 、抗體很快 被清除 、 不能有效激發(fā)免疫防御 系統(tǒng)等問題。 臨床診斷： 準(zhǔn)確 、 高效 、 簡易 、 快速 性傳播疾病 、 血型 、 懷孕或排卵 、 癌 （ 早期癌抗原的檢測 ） 作為載體 ， 運(yùn)載抗癌藥物 ， 形成 “ 生物導(dǎo)彈 ”治療腫瘤 。 （六）大規(guī)模培養(yǎng) —— 批量生產(chǎn)單克隆抗體 常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法： ◆ 動物接種法 ◆ 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法 ◆ 細(xì)胞培養(yǎng)罐法 培養(yǎng)上清中 X抗體的檢測 克隆化培養(yǎng) 單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中 X抗體的檢測 雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體 規(guī)?；囵B(yǎng) 獲得大量單克隆抗體 動物免疫 細(xì)胞融合 混合細(xì)胞的 HAT篩選 ) 分泌 X抗體 B淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 X抗原 B淋巴細(xì)胞 瘤的突變株 培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡 無限生長細(xì)胞 分泌 X抗體 只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來 BALB/c 雜交瘤技術(shù)操作流程圖解 抗體的檢測單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中 抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體獲得大量單克隆抗體篩選培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來四、單克隆抗體的應(yīng)用 與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體 產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高 ，優(yōu)越性十分明顯 。 問題：整個(gè)制備過程為何要經(jīng)過 兩次篩選 ? 第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞，但 這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞。 飼養(yǎng)層細(xì)胞（ feeder cell）可釋放某些 生長刺激因子 到培養(yǎng)液中，促進(jìn)了雜交瘤 細(xì)胞生長 ，并能 滿足雜交瘤對生長密度的需要 ，從而提高雜交瘤細(xì)胞存活率。 陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行 3～ 5次，直至得到基因型和表型穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。 常用克隆化方法： 有限稀釋法 軟瓊脂平板法 顯微操作法 通常用“ 有限稀釋法 ”來選擇： 將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用 多孔細(xì)胞培養(yǎng)板 培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。目的是利用單個(gè)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)從細(xì)胞群體中選育出 遺傳穩(wěn)定的能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞 ，淘汰非特異性的或遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 抗原 第 1抗體 酶 第 2抗體 待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液 底物 有色產(chǎn)物 酶標(biāo)儀檢測 抗原抗體復(fù)合物 產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 T, 胸腺嘧啶 融合細(xì)胞： 具有親代雙方的遺傳性能，具有 來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的 HGPRT與 TK ，因此 可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用 補(bǔ)救途徑合成 DNA， 因此可在HAT培養(yǎng)基中 存活與繁殖 。 骨髓瘤細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 沒融合的淋巴細(xì)胞 610天死亡 雜交瘤細(xì)胞 沒融合的骨髓細(xì)胞 如何選擇？ (三）融合細(xì)胞的篩選 HAT培養(yǎng)基篩選 DNA 內(nèi)源性途徑 (主要途徑 ) 谷氨酰胺 二氫葉酸還原酶 A H T 外源性途徑 (旁路途徑 ) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴細(xì)胞 ： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤細(xì)胞 ： HGPRT， TK 存活 死亡 外源性途徑 (旁路途徑 ) H, 次黃嘌呤 。 將不完全培養(yǎng)基加入融合細(xì)胞的過程要小心謹(jǐn)慎。 將融合后細(xì)胞懸液加入 96孔板 ， 100μL／孔 ， 37℃ 、 5％ CO2孵箱培養(yǎng) 。 加預(yù)熱不完全培養(yǎng)液 ， 終止 PEG作用 。 （二）雜交細(xì)胞融合 PEG誘導(dǎo)法： ? 將骨髓細(xì)胞：脾細(xì)胞按 1:4～ 1:10， 一般為 1:5混合 ， 并加入 PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合 ， 混合時(shí)間在１ min內(nèi) 。 ? 一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。 ◆ 骨髓瘤細(xì)胞的獲得 ? 骨髓瘤細(xì)胞： 需同時(shí)具有兩個(gè)獨(dú)特的性質(zhì) ?骨髓瘤細(xì)胞系 不能分泌抗體 ，否則雜交瘤細(xì)胞將分泌混合抗體； ? 要 選擇 次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶 缺陷型（ HGPRT） 或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 （ TK ） 。 三、單克隆抗體的制備過程 （一） 親本細(xì)胞的選擇 一般要經(jīng)過 初次免疫 、 第二次免疫 (向動物腹腔內(nèi)注射抗體 )、 加強(qiáng)免疫 (向動物靜脈內(nèi)注射抗體 )三個(gè)過程。 提取細(xì)胞并培養(yǎng) 細(xì)胞融合 B淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞 獲得的雜交細(xì)胞 （繼承雙親的特點(diǎn)） 檢驗(yàn)和篩選 雜交細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 得到化學(xué)性質(zhì)單一的，針對性強(qiáng)的抗體 培養(yǎng)基篩選 ◆ B 淋巴細(xì)胞 的獲得 ?經(jīng)特定抗原免疫的 能產(chǎn)生目的抗體 的動物淋巴細(xì)胞； ?免疫動物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或 有相近的親源關(guān)系 。 細(xì)胞融合技術(shù) 脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞 ) 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 長命 不分泌抗體 分泌抗體 短命 分泌抗體 長命 1984年 Nobel醫(yī)學(xué)獎 二、雜交瘤技術(shù) (hybridoma technology）定義 用 骨髓瘤細(xì)胞 (myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的 B淋巴細(xì)胞 (antigen stimulated B lymphoblast)融合得到 雜交瘤細(xì)胞 (hybridoma cell)
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