流式細胞術(shù)在哺乳動物精液質(zhì)量檢測中的應(yīng)用-文庫吧資料
2025-07-13 15:11本頁面
【正文】 色熒光，R123在精子頭部和尾部有非特異性染色，MITO只在精子頭部有非特異性染色。JC1在檢測精子線粒體膜電位方面具有重要作用：在精子線粒體膜電位低時，以單體形式存在，發(fā)綠色熒光；當膜電位高時，形成J聚體，發(fā)橙色熒光。R123可檢測精子線粒體有無功能，但不能區(qū)別線粒體膜電位的高低。常用的檢測線粒體功能的熒光探針有：Rhodamine 123（R123）、MITO和JC1。SCSA也能很好的監(jiān)測各種化療藥物對精子發(fā)生的影響（Spano et al,1996）。小鼠睪丸若暴露于高于正常生理溫度的環(huán)境中，會損傷精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性，這一指標比精子頭部形態(tài)檢測更靈敏（Sailer et al,1997）。Kobayashi et al（2001）發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)癌癥患者精子的DNA損傷普遍存在，αt、COMPαt值顯著高于正常對照組。梯度離心法雖然在精子活動率以及正常形態(tài)方面優(yōu)于玻璃纖維過濾法，后者卻能提高精子DNA完整性（SDα t）和活力（Larson et al,1999）。精液的體外處理是否會影響精子DNA完整性是需要慎重考慮的問題。）％，P＝]；認為如果精子的COMPαt179。Larson et al（2000）對SCSA在體外受精（IVF）和胞質(zhì)內(nèi)單精注射（ICSI）妊娠結(jié)果的預測效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)7例妊娠成功者與14例妊娠失敗者相比，其精子的COMPαt值差異顯著[（177。Evenson et al（1999）提出COMPαt是預測妊娠成敗的最佳指標，COMPαt179。通過專用軟件進行數(shù)據(jù)處理，SCSA可檢測下列參數(shù)：α t（指紅色熒光與總熒光的比值，即α t=紅/紅+綠）；COMPαt( cells outside the main population，指主群以外的精子占總數(shù)的比例)；SDα t(the standard diviation of alpha t，指α t的標準差)；HIGRN(high green stainability，指綠色熒光可染性增加的精子所占百分數(shù))。通過熱處理，來自低生育力的牛、小鼠和人精子的染色質(zhì)更容易變性（Evenson et al，1980）；采用酸變性處理對人和動物精液的研究得到相同的結(jié)論(Evenson et al,1999，2000；Bochenek et al，2001)。用PI染色來檢測精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性報道的還較少，實驗方法還不統(tǒng)一，提供的信息也很較少，故應(yīng)用并不廣泛。異常精子DNA直方圖主峰加寬，右移，出現(xiàn)小的附加峰,DNA熒光值與精子正常形態(tài)百分率呈顯著負相關(guān)（Huang amp。檢測精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性有PI染色和吖啶橙（acridine orange,AO）染色兩種方法。3 檢測精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性對于精確傳遞遺傳物質(zhì)至關(guān)重要。精子獲能后細胞膜流動性增大，染色強，染料分布在質(zhì)膜的外層。Ca2+內(nèi)流是精子獲能的一種表現(xiàn)形式，因此可用鈣離子探針（如fluo3和indo1等）檢測Ca2+的濃度變化（Harrison et al,1993）。完整頂體的活精子呈酸性，可被嗜酸性探針LysoTracker特異標記，呈綠色熒光。凝集素對精子有一定毒性，染色時間不宜過長。②不經(jīng)固定，直接用精子活力染料PI（或Hoechst 3325EthD1）和FITCPNA標記。Tao et al（1993a）先用Hoechst 33258標記，之后加入一定量鮭魚精子DNA（SSDNA）結(jié)合多余的染料，洗滌后再固定，再用FITCPNA標記，Hoechst 33258陰性、PNA陽性者為頂體反應(yīng)的精子。死亡降解的精子也會出現(xiàn)頂體丟失，但只有活精子的頂體丟失才能稱為真正的頂體反應(yīng)。FITCPNA檢測頂體反應(yīng)有兩種樣品處理方法：①樣品需要固定，F(xiàn)ITCPNA才能穿過質(zhì)膜和頂體外膜，標記頂體。其中PNA和PSA較常用，PNA效果最好。因此可以利用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的凝集素檢測精子的頂體狀態(tài)。但這種染料在FCM檢測時不能很好地將獲能與未獲能的精子分開，而且樣品要固定，所以CTC染色法不適用于FCM（Rathi et al,2001）。因此檢測精子的頂體狀態(tài)，有助于反映精子的受精能力。而其他組合染色時間長，標記的細胞器不同，易出現(xiàn)誤差。一般認為，在精子活力檢測的所有方法中，SYBR14與PI的聯(lián)合使用效果最佳。這一染色方法適用于流式和熒光顯微鏡檢測，且可以和發(fā)綠色或黃色熒光的其他探針合用，同時檢測多個指標。Hoechst 33342是一種膜通透性活體染料，死精子和活精子都標記，而PI只標記死精子。這一組合的優(yōu)點是可以和發(fā)綠色熒光的頂體探針結(jié)合。CFDA、CMFDA、SYTO17等分別與PI聯(lián)合染色，通過流式細胞儀檢測也可得到類似的3類精子。樣品經(jīng)流式細胞儀檢測可得3種亞群：①被SYBR14染成綠色的活精子，并且比死精子亮得多；②被PI染成紅色的死精子；③同時染上并發(fā)出兩種熒光的雙陽性精子，正處于從活向死的過渡狀態(tài)。 Johnson，1995）。對死精子特異的熒光染料雖然可以單獨使用，但效果不如聯(lián)用好。Ericsson et al,1989)。它們是膜通透性的染料，能進入細胞膜完整的精子。它們是膜不透性的DNA探針，只有質(zhì)膜破損的精子，染料才能進入細胞與DNA結(jié)合。1 測定精子的質(zhì)膜完整性精子的質(zhì)膜完整性又可稱為精子的活力（viability），是檢測精液質(zhì)量的重要指標之一，也是FCM應(yīng)用最多的領(lǐng)域。隨著新的熒光探針和染色方法的不斷開發(fā)和改進，這一新的檢測技術(shù)在近20年來應(yīng)用越來越廣泛，也必將在人類輔助生殖技術(shù)、畜牧業(yè)凍精商業(yè)化運作以及珍稀瀕危物種的精子凍存研究中展現(xiàn)更加廣闊的應(yīng)
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