【正文】 的含硒量。因此，金針菇201誘變10min菌種在培養(yǎng)基含硒量為5μg/L的時(shí)候，富硒能力最強(qiáng)，；在培養(yǎng)基含硒量為30μg/L的時(shí)候，生長(zhǎng)速度均達(dá)到最大。可見適宜濃度硒含量的發(fā)酵液有助于金針菇201誘變10min菌種的生長(zhǎng)及其富硒能力的提高。在培養(yǎng)基硒含量為5μg/L時(shí)，菌絲體富硒能力遠(yuǎn)高于其他硒濃度梯度。圖8:金針菇201誘變10min菌種菌絲體含硒量和干重與硒濃度梯度的曲線圖 Curves of the selenium and dry weight of mycelium of Flammulina velutipes () in different selenium concentration gradient由表11和圖8可知，金針菇201誘變10min菌種在富硒CM液體培養(yǎng)基上具有較強(qiáng)的富硒能力。綜合考慮菌種生長(zhǎng)速度、富硒能力及發(fā)酵培養(yǎng)基硒含量的回收率，因而較好的培養(yǎng)方案為配置含硒量為20μg/L的培養(yǎng)基發(fā)酵金針菇201誘變5min菌種菌絲體。隨著培養(yǎng)基硒濃度梯度的增加，硒的回收率呈下降趨勢(shì)且較為明顯。其菌絲球干重，在0、20μg/L的硒濃度的時(shí)候達(dá)到了頂峰。菌絲體的含硒量、干重與硒濃度的關(guān)系不顯著。表10 金針菇201誘變5min菌種()在液體富硒培養(yǎng)基中對(duì)硒的富集特性Table characteristics of Flammulina velutipes () in the seleniumenriched medium培養(yǎng)液硒濃度(μg/L)生物量干重(g/100mL)菌絲體的吸光值菌絲體含硒量(μg/g)硒含量提高倍數(shù)硒回收率（％）CK51015—————20253040注：每個(gè)硒濃度梯度下。因此，金針菇201原種在培養(yǎng)基含硒量為5μg/L的時(shí)候，富硒能力最強(qiáng)，在培養(yǎng)基含硒量為0μg/L的時(shí)候，生長(zhǎng)速度均達(dá)到最大?？梢姷蜐舛任康陌l(fā)酵液有助于金針菇201原種的生長(zhǎng)及其富硒能力的提高。菌絲體的富硒能力隨著硒濃度的增加而上下波動(dòng)，在培養(yǎng)基硒含量為15和40μg/L時(shí)菌絲體含硒量曲線出現(xiàn)三處峰值，但在5μg/L時(shí)其富硒能力遠(yuǎn)高于其他兩個(gè)梯度。表9 金針菇201原種()在液體富硒培養(yǎng)基中對(duì)硒的富集特性Table 9. Seaccumulated characteristics of Flammulina velutipes 201 in the seleniumenriched medium培養(yǎng)液硒濃度(μg/L)生物量干重(g/100mL)菌絲體的吸光值菌絲體含硒量(μg/g)硒含量提高倍數(shù)硒回收率（％）CK5101520253040注：每個(gè)硒濃度梯度下。因此，白色金針菇誘變10min菌種在培養(yǎng)基含硒量為15μg/L的時(shí)候，富硒能力及生長(zhǎng)速度均達(dá)到較佳值?？梢娺m宜濃度的發(fā)酵液硒含量有助于白色金針菇原種的生長(zhǎng)。其菌絲球干重，在15μg/L的硒濃度的時(shí)候達(dá)到了頂峰，顯著高于所測(cè)的其他硒濃度梯度。圖5 白色金針菇（）菌種菌絲體含硒量和干重與硒濃度梯度的曲線圖 Curves of the selenium and dry weight of mycelium of Flammulina velutipes () in different selenium concentration gradient由表8和圖5可知，白色金針菇誘變10min菌種在富硒CM液體培養(yǎng)基上具有較強(qiáng)的富硒能力。綜合考慮，可選取含硒量為5μg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)白色金針菇誘變5min菌種菌絲體，此時(shí)其富硒能力及菌絲球干重均處于較佳狀態(tài)。因此，白色金針菇誘變5min菌種在培養(yǎng)基含硒量為0和30μg/L的時(shí)候，富硒能力達(dá)到最大。菌絲球干重在該硒濃度范圍內(nèi)，在5μg/L時(shí)達(dá)到了頂峰。在所測(cè)硒濃度范圍內(nèi)，菌絲體的富硒能力出現(xiàn)了兩個(gè)峰值，分別是在培養(yǎng)基硒含量為0和30μg/L時(shí)富硒能力最強(qiáng)。 圖3 白色金針菇菌種菌絲體含硒量和干重與硒濃度梯度的曲線圖 Curves of the selenium and dry weight of mycelium of white Flammulina velutipes in different selenium concentration gradient 表7 Table characteristics of white Flammulina velutipes ()in the Seleniumenriched medium培養(yǎng)液硒濃度(μg/L)生物量干重(g/100mL)菌絲體的吸光值菌絲體含硒量(μg/g)硒含量提高倍數(shù)硒回收率（％）CK5 10 15 20 25 30 40 注：每個(gè)硒濃度梯度下。所以最佳育種方案是選擇含硒量為20μg/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)白色金針菇原種菌絲體。隨著培養(yǎng)基硒濃度梯度的增加，硒的回收率呈下降趨勢(shì)。菌絲體的含硒量與干重呈正相關(guān)。添加高濃度硒(40μg/L)時(shí)，富硒能力明顯下降（%）。 金針菇在液體富硒培養(yǎng)基中的富硒特性由表6和圖3可知，白色金針菇原種在富硒CM液體培養(yǎng)基上具有較強(qiáng)的富硒能力。2)轉(zhuǎn)速為250r/min,溫度為25℃；3）在測(cè)定滅菌前pH值時(shí)，緩沖液的實(shí)時(shí)溫度是12℃，緩沖液的pH值按照10℃的標(biāo)準(zhǔn)來校正pH計(jì)。在本實(shí)驗(yàn)中，我觀察到，菌絲球小的培養(yǎng)液中菌絲球的數(shù)目多，生物量也大，干燥時(shí)間也比較快。菌絲球基本呈現(xiàn)白色，隨著硒濃度的提高，滅菌前pH值逐漸升高。本次實(shí)驗(yàn)觀察了白色金針菇、金針菇201及其誘變菌株在液體富硒培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)特性，由表3~4可知：發(fā)酵液基本清澈透明，透出淡淡的香味，表明這些培養(yǎng)基未被污染。2)轉(zhuǎn)速為250r/min,溫度為25℃；3）在測(cè)定滅菌前pH值時(shí)，℃，緩沖液的pH值按照20℃的標(biāo)準(zhǔn)來校正pH計(jì)。該曲線僅用于金針菇201菌種及其誘變菌種在液體發(fā)酵中所獲得的菌絲體富硒能力的測(cè)量。表1：測(cè)定硒的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table of selenium standard curve硒含量(μg)0612182430吸收值0注：此次使用玻璃比色皿測(cè)定，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。記錄下生物量干重、吸光值，計(jì)算出菌絲體含硒量、含硒量提高倍數(shù)和回收率。實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果分別在下列的表格和數(shù)據(jù)圖形中一一列出。觀察發(fā)酵液的濁度，菌絲球的色、香、味及其形狀，測(cè)定菌液pH和菌絲球直徑，測(cè)菌絲球數(shù)目及其干重，記錄各個(gè)菌種各個(gè)梯度菌絲球干燥所需的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)金針菇20白色金針菇及其紫外誘變菌種進(jìn)行了條件優(yōu)化的液體富硒培養(yǎng)，使金針菇菌絲體在液體培養(yǎng)基中能夠充分的接觸到培養(yǎng)基。我設(shè)置了0、10min中的時(shí)間梯度，隨后在平板中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)紫外誘變時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲體的生長(zhǎng)速率明顯下降，并且菌絲越顯得瘦弱。以吸收值A(chǔ)對(duì)硒含量回歸，獲得回歸方程。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別取硒標(biāo)準(zhǔn)液0，于250 mL錐形瓶中，相當(dāng)于分別含硒0，6，12，18，24，30μg/mL，經(jīng)過消化、提硒、萃取、測(cè)定步驟后，獲得其在335nm處的吸收值。將錐形瓶移至紫外分光光度計(jì)旁的通風(fēng)處,使用移液管加入甲苯10mL,振蕩1min,將混合液倒入大試管（70mL）中,將大試管放入試管架上，靜置10min。③ 萃取 %鄰苯二胺溶液2mL,搖勻后靜置2h。反應(yīng)放熱并有刺激性氣體使用8mol/LNaOH溶液和pH計(jì)調(diào)混合溶液pH為中性。向溶液中加入蒸餾水35mL。然后將其放置在水浴鍋中加熱，瓶中產(chǎn)生大量翻滾的白霧。在通風(fēng)處，向錐形瓶中加入鉬酸鈉溶液3ml，可看到冒出白霧，鉬酸鈉加入完畢后迅速將塞子塞上，防止白霧擴(kuò)散至空氣中。在室溫下放置24h，瓶中菌絲粉末被消化成糊狀。 在參考文獻(xiàn)地基礎(chǔ)上[16]，我們做了改進(jìn)：明確了硫酸高氯酸消化時(shí)間和水浴鍋加熱反應(yīng)時(shí)間，我們通過在通風(fēng)處操作以及將錐形瓶蓋上塞子，防止具有刺激性氣味的白霧進(jìn)入空氣，危害身體健康，將其中激烈反應(yīng)這一并不明顯的特征表現(xiàn)刪除，將冒白煙這一特征改成冒白霧，其出現(xiàn)的時(shí)間我們按照實(shí)驗(yàn)事實(shí)做了更正，使用100℃水浴鍋代替電沙浴達(dá)到節(jié)能效果，菌絲體與子實(shí)體不同，我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)，明確提醒出可能會(huì)出現(xiàn)問題的地方，防止操作不慎產(chǎn)生惡果，提醒使用塑料瓶盛裝濃NaOH溶液，硫酸高氯酸消解液配置好后應(yīng)避光保存，因EDTA溶解度較低，實(shí)驗(yàn)中使用EDTA二鈉鹽代替EDTA。收集菌絲球于稱量瓶，在電熱恒溫干燥箱（溫度設(shè)置為60℃）中烘干至恒重，用電子分析天平稱其干重。③ 測(cè)干重 使用2層紗布過濾液體富硒培養(yǎng)基中的菌絲球，置于培養(yǎng)皿，加入蒸餾水充分洗滌，過濾。② 測(cè)菌絲球直徑 將液體富硒培養(yǎng)所獲得的金針菇菌絲球及其培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中。收集菌絲體于稱量瓶，在電熱恒溫干燥箱（溫度設(shè)置為60℃）中烘干至恒重，用電子分析天平稱其干重。在載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，用鑷子取出菌絲，放置在染色液中，使用40倍目鏡測(cè)定其直徑。計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速率。① 測(cè)定菌絲粗細(xì)、疏密程度、色澤。設(shè)置一不接種的、不含硒的空白對(duì)照。④ 培養(yǎng)基、超凈臺(tái)的滅菌 ⑤ 液體富硒培養(yǎng)基的無菌檢驗(yàn) 與斜面無菌檢驗(yàn)方法一致，在25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3d后，只有當(dāng)發(fā)酵液依然保持原來的清澈程度，才可使用。將每個(gè)600mL富硒CM培養(yǎng)基母液分裝至6個(gè)錐形瓶中，貼上標(biāo)簽。配置液體CM培養(yǎng)基，向各個(gè)燒杯中加入液體CM培養(yǎng)基600mL，搖勻，獲得各個(gè)硒濃度梯度的液體富硒CM培養(yǎng)基母液。① 配置液體富硒CM培養(yǎng)基 取8個(gè)錐形瓶編號(hào)。⑥ 富硒培養(yǎng) 將平板置于電熱恒溫培養(yǎng)箱25℃，培養(yǎng)9d。⑤ 接種 將金針菇母種接種至富硒培養(yǎng)基，其中母種設(shè)置為田野金針菇20野樹林白色金針菇，誘變梯度設(shè)置為10min，硒濃度梯度為0、12340（μg/L）?！?”代表培養(yǎng)基含硒量為“0”，其他以此類推。取出錐形瓶，將200mL富硒CM培養(yǎng)基母液分裝至6套培養(yǎng)皿。打開超凈臺(tái)上的紫外燈，滅菌30min。② 滅菌 錐形瓶用8層紗布、牛皮紙包扎后，放入滅菌鍋中滅菌。向9個(gè)錐形瓶中各加入硒儲(chǔ)備液0、8mL。本次實(shí)驗(yàn)，我將培養(yǎng)基富硒濃度梯度設(shè)置為0、12340(μg/L)[12]。培養(yǎng)過程中要勤檢查,當(dāng)菌絲體長(zhǎng)滿斜面，及時(shí)挑選無污染、菌絲濃白粗壯的固化菌種,放在4℃冰箱中保藏,每隔3個(gè)月時(shí)間移植轉(zhuǎn)管一次。菌種保藏的方法有多種，斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、半固體穿刺保藏法、沙土管保藏法、加入保護(hù)劑凍存保藏法、冷凍真空干燥保藏法等[11]。穩(wěn)定的保藏保證了優(yōu)良菌株的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，也可以作為分離菌株的對(duì)照和驗(yàn)證研究結(jié)果。③ 每次轉(zhuǎn)管都應(yīng)在菌絲濃白粗壯處挑取菌種塊。 菌絲體的活化與復(fù)壯① ，繼續(xù)轉(zhuǎn)管2次，每次培養(yǎng)9d。揭開培養(yǎng)皿的蓋子，開啟紫外燈，直接照射菌種塊上的菌絲體，進(jìn)行紫外誘變，一批照射5min，一批照射10min。在火焰無菌區(qū)，左手拿培養(yǎng)皿，將菌種塊轉(zhuǎn)接至平板上。⑧ 超凈臺(tái)的滅菌 ⑨ 接種 點(diǎn)燃酒精燈，將復(fù)壯后的白色金針菇和金針菇201，使用接種鉤，178。在酒精燈火焰的無菌區(qū)，將錐形瓶中的培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，厚度以培養(yǎng)基能覆蓋培養(yǎng)皿底部即可。點(diǎn)燃酒精燈。⑥ 倒平板 取酒精棉球，蘸上酒精后，擦拭錐形瓶表面。內(nèi)部裝有綜合馬鈴薯培養(yǎng)基的錐形瓶放置在鍋內(nèi)，水浴加熱。④ 超凈臺(tái)的滅菌 取75%酒精棉球蘸上75%酒精將超凈工作臺(tái)表面消毒，并開啟紫外線燈滅菌30min。另外6套的處理方法與此相同。 紫外誘變① 材料準(zhǔn)備 報(bào)紙、棉球、75%酒精、75%酒精棉球② 儀器準(zhǔn)備 培養(yǎng)皿、酒精燈、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電爐③ 培養(yǎng)皿干熱滅菌 取培養(yǎng)皿12套，洗凈后晾干。將接種鉤在火焰上灼燒至紅，放回超凈臺(tái)。迅速通過酒精燈火焰無菌區(qū)，把菌種塊送入斜面培養(yǎng)基的中央。在菌絲濃密處，178。在火焰上灼燒試管口，灼燒時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)試管，將其沾上的少量雜均燒死。右手拿接種鉤，在裝有酒精的瓶子中蘸一下，然后在火焰上燒紅，進(jìn)行灼燒滅菌。將所要母種和斜面培養(yǎng)基用大拇指和其他四指并排握住，斜面向上，并使試管位于水平位置。④ 菌絲體的轉(zhuǎn)管 點(diǎn)燃酒精燈開始接種操作。 菌絲體轉(zhuǎn)管 ① 材料準(zhǔn)備 接種鉤、棉球、鑷子、75%酒精棉球、75%酒精、金針菇母種培養(yǎng)基、酒精燈② 超凈工作臺(tái)的滅菌 在接種前，取75%酒精棉球蘸上75%酒精將超凈工作臺(tái)表面消毒，將待接種的斜面培養(yǎng)基放入超凈臺(tái)內(nèi)，并開啟紫外線燈滅菌30min。在高溫季節(jié)，培養(yǎng)基滅菌后，待鍋內(nèi)溫度降至50℃時(shí)，取出大試管，將大試管頭部枕在小木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜，斜面長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的?，覆蓋保溫物讓其自然緩慢冷卻，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。二者均不宜金針菇的生長(zhǎng)。開啟紫外燈，30min后關(guān)閉。? 超凈工作臺(tái)的滅菌 在超凈工作臺(tái)下放一根長(zhǎng)50cm的小木條，厚度為1cm左右。對(duì)于錐形瓶，直接將橡膠塞塞上，包上牛皮紙。塞進(jìn)試管。剩余的綜合馬鈴薯培養(yǎng)基倒入錐形瓶。為宜。⑧ 分裝試管 先在玻璃漏斗嘴上套一段乳膠管，卡上止流夾，將培養(yǎng)基倒入漏斗中。⑦ 調(diào)節(jié)pH 加水定容后，用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基中的pH，～。⑤ 瓊脂融化 稱取瓊脂20g，洗凈剪碎，加入馬鈴薯煮出液中，用文火加