酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究-文庫吧資料
2025-06-01 22:00本頁面
【正文】 ，曲線的起始部分在某一段時(shí)間范圍內(nèi)呈直線，其 斜率 代表酶反應(yīng)的初速度。 表 1 級(jí)分 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 的酶活力測(cè)定 各管名稱 → 對(duì)照 粗級(jí)分 Ⅰ 熱級(jí)分 Ⅱ 上清 醇級(jí)分 Ⅲ IV 葡萄糖 管數(shù) → 1 2 3 4 5 6 7 8 酶液 (ml) 0 0 H2O(ml) 乙酸緩沖液 () 0 0 葡萄糖 2mmol/L 0 0 0 0 0 0 0 蔗糖 加入 蔗糖 ，立即搖勻開始計(jì)時(shí)， 25度準(zhǔn)確反應(yīng) 10min后，立即加堿性銅試劑中止反應(yīng)。這些具有還原性的糖與 堿性銅試劑 混合加熱后被氧化，二價(jià)銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與 磷鉬酸 作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測(cè)定光吸收值。 費(fèi)林試劑法靈敏度較高，但數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，因?yàn)榉磻?yīng)后溶液的顏色隨時(shí)間會(huì)有變化，因此加樣和測(cè)定光吸收值時(shí)最好能計(jì)時(shí)。各級(jí)分先要仔細(xì)尋找和試測(cè)出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細(xì)記錄稀釋倍數(shù)的計(jì)算（使用移液管和量筒稀釋）。 注意：從上樣開始收集，可能有兩個(gè)活性峰，梯度洗脫開始前的第一個(gè)峰是未吸附物，本實(shí)驗(yàn)取用梯度洗脫開始后洗下來的活性峰。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約 20ml緩沖液 洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì) ，至 A280降到 ，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細(xì)塑料導(dǎo)管放入不含 NaCl的低離子強(qiáng)度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個(gè)小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余 30ml高離子強(qiáng)度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速 。 用 2ml TrisHCl緩沖液充分溶解醇級(jí)分 Ⅲ ，若溶液混濁，則用小試管， 10000rpm離心 除去不溶物。（一般洗 23個(gè)柱體積） ： 上樣前先準(zhǔn)備好梯度洗脫液，本實(shí)驗(yàn)采用 30ml TrisHCl緩沖液和 30ml含 1MNaCl的 TrisHCl緩沖液，進(jìn)行線性梯度洗脫。最后保存在 20%的酒精溶液中。（因 DEAE纖維素昂貴，用后務(wù)必回收）。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)。 ⑵上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液 ⑶洗脫與收集 不同樣品選用的洗脫液不同。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會(huì)影響分離效果。使用的酸堿濃度一般小于 mol / L，浸泡時(shí)間一般 30 min。處理時(shí)一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。干粉狀的離子交換劑首先要進(jìn)行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來。當(dāng)使用陽離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高溶液 pH值。 pH值降低時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對(duì)陰離子交換劑的吸附。 一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的 pH值。當(dāng) Cl的濃度大時(shí)，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng) Cl濃度小時(shí)，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液 pH值發(fā)生改變，就會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個(gè)分離開來。
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1