【正文】 ； 6. ） 定量測(cè)定； 電泳的基本原理及過程 由于 SDS 帶有大量負(fù)電荷 ,當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用 Mr 差異將各種蛋白質(zhì)分開。 當(dāng)電場(chǎng)沿切線方向作用于帶電表面時(shí)，雙電層的兩部分分別受到相反方向的作用力，膠粒在分散介質(zhì)中朝著某一電極遷移 動(dòng)電過程 參考教材 （ 1）自由界面電泳 （ 2）自由溶液中的區(qū)帶電泳 （ 3）在不同支持物上的區(qū)帶電泳 （ 4）在有機(jī)溶劑中的凝膠電泳 （ 5）親和電泳 （ 6）等速電泳 （ 7）等電聚焦電泳 ？ （ 1）顆粒的性質(zhì)（ 2）電場(chǎng)強(qiáng)度（ 3）溶液的性質(zhì) （ 4） 焦耳熱 （ 5） 支持物 （ 6） 擴(kuò)散 （ 7）緩沖液的性質(zhì) ？ (1) 瓊脂凝膠和瓊脂糖凝膠 (2) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (3)不連續(xù)凝膠電泳 (4)制備凝膠電泳 （ 1）電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽 （ 2）電源 :聚丙烯酰胺凝膠電泳 200~600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳 1000~2020V，固相梯度等電聚焦 3000~8000V （ 3）外循環(huán)恒溫系統(tǒng) :高電壓會(huì)產(chǎn)生高 熱，需冷卻； (4）凝膠干燥器 :用于電泳和染色后的干燥 （ 5）灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子； （ 6）電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場(chǎng)，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如 PVDF 膜 （ 7）電泳洗脫儀：回收樣品 （ 8）凝膠掃描和攝錄裝置：對(duì)電泳區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而給出定量的結(jié)果 原理： 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對(duì)流，把擴(kuò)散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級(jí)，能主動(dòng)參與生物分子的分離，具有分子篩效應(yīng)。 22/1 )( WtN R? 2)(16bRWtN?NLH?9 高效液相色譜的分離原理及應(yīng)用 10 蛋白質(zhì)分離的常用色譜方法有哪些？ 免疫親和層析 、 疏水層析 、 離子交換色譜 （ 最常用的蛋白質(zhì)分離手段 ）、 u 課后習(xí)題 1 P281 u 色譜方法共分幾類？常用的蛋白質(zhì)分離方法有哪些？并簡(jiǎn)述其原理 u 何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計(jì)算？ u 簡(jiǎn)述高效反相液相色譜的工作原理？ u 簡(jiǎn) 述 HIC 的工作原理？ 經(jīng)溴化氰活化的瓊脂糖與烷基氨反應(yīng)，生成改性的瓊脂糖，具有新的吸附能力，并且對(duì)蛋白質(zhì)還有分辨能力，主要是由于蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與載體上烷基殘基的疏水區(qū)域相互作用的結(jié)果，這樣就通過疏水基團(tuán)的疏水力分離生物大分子。 分類： (1) 聚丙烯酰胺凝膠 (2) 葡聚糖凝膠 (3) 瓊脂糖凝膠 8 離子交換及疏水作用層析的原理 離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán) (或功能基團(tuán) )和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基因以共價(jià)鍵連 接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。 陽(yáng)離子交換樹脂、陰離子交換樹脂 (分別包括強(qiáng)、中、弱三種電荷基團(tuán) )， 螯合離子交換樹脂 (對(duì)金屬離子有較強(qiáng)的選擇性 ) 應(yīng)用：分離氨基酸 7 凝膠色譜的分離原理及分類 原理： 當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。 5 什么是分配色譜？ 利用溶質(zhì)各組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法。 ？其主要的理化性質(zhì)有哪些？ 強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂 ， 弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂 ， 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂 ， 弱堿性陰離子交換樹脂 ， 大孔離子交換樹脂 ， 兩性樹脂 ， 螯合樹脂 ， 多糖基離子交換樹脂 （ 離子交換纖維素 ， 葡聚糖凝膠離子交換樹脂 ） 理化性質(zhì)： 外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為 16~60 目 90%； 機(jī)械強(qiáng)度： 90%； 含水量： ~； 交換容量：重量交換容量、體積交換容量、工作交換容量或稱表觀交換容量（在某一條件下）； 穩(wěn)定性：化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性； 膨脹度：交聯(lián)度、活性基團(tuán)的性質(zhì)與數(shù)量、活性離子的性質(zhì)、介質(zhì)的性質(zhì)和濃度、骨架結(jié)構(gòu)； 濕真密度：?jiǎn)挝惑w積濕樹脂的重量； 孔度、孔徑、比表面積 ？ A+自溶液中擴(kuò)散到樹脂表面 A+從樹脂表面進(jìn)入樹脂內(nèi)部的活性中心 A+與 RB 在活性中心上發(fā)生復(fù)分解反應(yīng) 解吸附離子 B+自樹脂內(nèi)部擴(kuò)散至樹脂表面 B+離子從樹脂表面擴(kuò)散到溶液中 交換速度的控制步驟是擴(kuò)散速度，不同的分離體系可能 由內(nèi)部擴(kuò)散或外部擴(kuò)散控制 ？其選擇性受哪些因素影響？ 水合離子半徑：半徑越小，親和力越大； 離子化合價(jià)：高價(jià)離子易于被吸附； 溶液 pH：影響交換基團(tuán)和交換離子的解離程度，但不影響交換容量； 離子強(qiáng)度：越低越好； 有機(jī)溶劑：不利于吸附； 交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少； 樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力； 離子交換的選擇性 — 離子交換常數(shù)：交換勢(shì)或交換系數(shù) [RA]、 [RB]表示結(jié) 合在樹脂上的 A 離子和 B 離子濃度 [A]S、 [B]S 表示溶液中 A 離子和 B 離子 越大 B 越易被交換 ？ 1） 樹脂預(yù)處理 —— 物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒； 化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型（氫型或鈉型） 陽(yáng)離子樹脂 酸 —堿 —酸 陰離子樹脂 堿 —酸 —堿 最后以去離子水或緩沖液平衡 2） 離子交換吸附 3） 洗脫 —— （ 1）改變?nèi)芤?pH 值（ 2） 改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度 4） 樹脂再生 ： 是指使離子交換樹脂重新具有交換能力的過程 酸性陽(yáng)離子樹脂 酸 堿 酸 緩沖溶液淋洗 堿性陰離子樹脂 堿 酸 堿 緩沖溶液淋洗 方式有：順流再生和逆流再生 ？ 平衡 、 上樣吸附 、 洗脫 、 再生 ？ 顆粒大?。河≡娇? 交聯(lián)度：交聯(lián)度小，交換速度快 溫度：越高越快 離子化合價(jià)：化合價(jià)與高，交換越快 離子大?。涸叫≡娇? 攪拌速度：在一定程度上，越大越快 溶液濃度：當(dāng)交換速度為外擴(kuò)散控制時(shí)， 濃度越大，交換速度越快 ，主要有哪幾類 要求：良好的親水性、具有較大的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)、粒度越小分辨率越高 種類：多糖類 離子交換纖維素