【正文】 交聯(lián)葡聚糖 交聯(lián)瓊脂糖 聚乙烯醇類(lèi) Mono 系列 Amersham Pharmacia 色譜分離技術(shù) ssBA BAR ABRK ]][[ ]][[ ???ssBA AB ARBRK ]/[][ ]/[][ ???BAK1 什么是色譜分離技術(shù)？ 利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì) (分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、 分子親和力、分配系數(shù)等 )的不同，使各組分以不同程度分布在 固定相 （多孔介質(zhì)）和 流動(dòng)相 中，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)固定相時(shí)，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同，各組分以不同的速度移動(dòng)，經(jīng)過(guò)多次分配（吸附 解吸 吸附 解吸 … ），而達(dá)到分離的技術(shù)。 特點(diǎn)： 效率高：利用親和吸附可以從粗提液中一次性分離得到高純度的活性物質(zhì)。 吸附等溫線表示平衡吸附量，并可用來(lái)推斷吸附劑結(jié)構(gòu)，吸附熱，和其他理化特性。如果不考慮溶劑的吸附，當(dāng)固體吸附劑與溶劑中的溶質(zhì)達(dá)到平衡時(shí)，其吸附量 m 應(yīng)與溶質(zhì)的濃度和溫度有關(guān)。如組氨酸－氯化汞，精氨酸－苯甲醛，亮氨酸－鄰二甲基苯磺酸等 分離核酸用沉析劑 ： 酚、氯仿、 SDS 分離粘多糖用沉析劑 ： 乙醇、 CTAB 選擇性變性沉淀法 ： 加入變性劑 、 選擇性熱變性 、 選擇性酸堿變性 吸附與離子交換 ？ 吸附： 利用吸附劑對(duì)液體或氣體中某一組分具有選擇性吸附的能力，使其富集在吸附劑表面的過(guò)程。 金屬?gòu)?fù)合鹽：與生物分子的酸性基團(tuán)作用， Cu2＋、 Ag＋、 Zn2＋ 有機(jī)酸復(fù)合鹽：與生物分子的堿性基團(tuán)作用 無(wú)機(jī)復(fù)合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽 離子型表面活性劑 ： CTAB（十六烷基三甲基季銨鹽溴化物） 主要用于沉淀酸性多糖 、十二烷基磺酸鈉（ SDS） 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白 。 常用的此 類(lèi)沉淀劑是 PEG，相對(duì)分子量一般為 6000； 成鹽類(lèi)復(fù)合物沉析劑 ： （ 1）高價(jià)金屬鹽： Cu2+， Ag2+， Zn2+， Ca2+與酸性基團(tuán)結(jié)合； （ 2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質(zhì)等，與堿性基 團(tuán)結(jié)合 。（ pI） （ 4）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度低有利于沉析， （ 5）樣品濃度： % ?。喝軇┯昧看?，回收率低，但共沉淀作用小 濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強(qiáng)，分辨率低 （ 6）金屬離子的助沉析作用： Zn2+、 Ca2+ 等電點(diǎn)沉析的工作原理是什么？ 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液 pH 值處于等電點(diǎn)時(shí)，分子表面凈電荷為 0，雙電層和水化膜結(jié)構(gòu)被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進(jìn)而產(chǎn)生沉淀 。 鹽析操作時(shí)常用的鹽是什么？ 酸硫銨：溶解度大（ 767g/L） 硫酸鈉 磷酸鹽 檸檬酸鹽 影響鹽析的主要因素有哪些？ （ 1）溶質(zhì)種類(lèi)的影響： Ks 和 β 值 （ 2）溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低； （ 3）蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高； （ 4） pH 值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系 pH 值，使其在 pI 附近； （ 5）鹽析溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高 ，其溶解度反而下降； 有機(jī)溶劑沉析法的原理是什么？ （ 1）降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。 溶液中高濃度的中性鹽離子有很強(qiáng)的水化能力，會(huì)奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水，發(fā)生凝集而沉淀析出。 沉析法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)有哪些？ 沉析的一般操作步驟是什么？ 1 加入沉析劑 2 沉析物陳化 xyk /?])()(e xp[ RT lhxyk ?? ?? ???3 離心或過(guò)濾，收集沉析物 何謂鹽析？其原理是什么？ 在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過(guò)程。 ？其特點(diǎn)有哪些？ 超臨界流體：當(dāng)一種流體處于其臨界點(diǎn) 的溫度和壓力之下，則稱之為超臨界流體。 使含溶質(zhì)的溶液（ h）和萃取劑（ L）解出混合，靜止后分成兩層。 －液萃取從機(jī)理上分析可分為哪兩類(lèi)？ 小分子類(lèi)傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取系統(tǒng)，大分子類(lèi)生物質(zhì)的兩水相萃取系統(tǒng)。 特點(diǎn)：需要施加外壓，外壓大于滲透壓，膜允許 水分子通過(guò)，鹽類(lèi)和雜質(zhì)分子都比孔大 而無(wú)法通過(guò) ，逆濃度差滲透。 將離子交換膜浸入電解質(zhì)溶液中，并在兩側(cè)同以電流時(shí)，則只有與膜上固定電荷相反的離子才能通過(guò)膜。 一般說(shuō)來(lái)，無(wú)機(jī)小分子的滲透壓要比有機(jī)大分子溶質(zhì)的滲透壓高得多。 – 耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在 ~，反滲透膜的壓力更高，約為 1~10MPa – 耐高溫 :高通量帶來(lái)的溫度升高和清洗的需要 – 耐酸堿：防止分離過(guò)程中，以及清洗過(guò)程中的水解； – 化學(xué)相容性：保持膜的穩(wěn)定性； – 生物相容性：防止生物大分子的變性； 微濾 超濾 納濾 反滲透 懸浮顆粒 大分子有機(jī)物 糖類(lèi)等小分子有機(jī)物，二價(jià)鹽或多價(jià)鹽 單價(jià)鹽 – 成本低； 5 主要的膜組件類(lèi)型。 3 各種膜的分離特性。 微濾 、 超濾 、 反滲透 、 氣體分離、滲析、電滲析 、滲透蒸發(fā) 。 2 膜分離技術(shù)的分類(lèi)。名解： 5 3’ 填空： 15 1’ 選擇： 15 2’ 簡(jiǎn)答： 5選 4（ 4 7’）分析題： 1 12’（考實(shí)驗(yàn)中實(shí)際操作） （名解 填空 簡(jiǎn)答均出自 ppt上的問(wèn)題） 膜分離 1 膜分離技術(shù)的概念。 利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側(cè)存在的 能量差 作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。 普遍：膜內(nèi)平均孔徑，推動(dòng)力，傳遞機(jī)制。 生物技術(shù)應(yīng)用： 以靜壓力差為推動(dòng)力，靜壓力差不同 ： 微濾 、 超濾 、 反滲透 ； 利用 蒸氣分壓差為推動(dòng)力 ： 膜蒸餾 、 滲透蒸發(fā) ； 利用濃度差為推動(dòng)力 ： 滲析（透析） ； 利用電位差為推動(dòng)力 ： 電滲析 。 4 對(duì)于膜材料的基本要求。 ? 平板式 ? 管式 ? 中空纖維 ? 螺旋卷繞式 6 超濾和反滲透過(guò)程中滲透壓的影響 滲透壓的大小取決于溶液的種類(lèi)、濃度和溫度 。 7 超濾的基本方程 ：穿透度（單位時(shí)間、單位膜面積的處理量） 8 了解親和膜分離技術(shù) 分離膜的改性：通過(guò)化學(xué)改性，在載體表面連接上一條“手臂鏈”（大于三個(gè)碳原子）； （ 1）親和膜制備：選用合適的配基 (Ligand)，與手臂鏈相連，構(gòu)成帶有親和配基的分離介質(zhì)； （ 2）親和絡(luò)合：將混合物緩慢地通過(guò)膜，使要分 離的物質(zhì)與親和配