人工染色體載體ppt課件-文庫吧資料
2025-05-08 00:10本頁面
【正文】 難從中分離出來。 ? 容易形成嵌合體。 2022/5/25 47 ? ① 啟動子和終止子的選擇； ? ②表達(dá)盒的穩(wěn)定性； ? ③外源蛋白的累積部位； ? ④產(chǎn)量的提高。 選擇標(biāo)記 Sup4 2022/5/25 45 ? 一般酵母表達(dá)載體都以 大腸桿菌質(zhì)粒 為基本骨架再加上 酵母的自主復(fù)制序列，選擇標(biāo)記，外源基因插入位點(diǎn)，啟動子和終止子。 ? 不含外源 DNA片段的 pYAC4載體轉(zhuǎn)化酵母菌，轉(zhuǎn)化子的菌落呈白色。 在成功構(gòu)建 pYAC4克隆載體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了人類人工染色體 (HAC)克隆載體和哺乳動物人工染色體 (MAC)克隆載體。 克隆載體pYAC4 首先用 EcoRI和 BamHI雙酶切割，獲得均具BamHI和 EcoRI切割末端的兩個 DNA片段 (雙臂 )，隨后把兩端具 EcoRI切割末端的外源 DNA與此雙臂連接，構(gòu)成酵母人工染色體。 差別： 在 sup4基因上的克隆位點(diǎn)不同，分別是SnaBI、 EcoRI和 NotI。 2022/5/25 38 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 二、 YAC載體的工作原理 EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 此克隆載體的 sup4(抑制基因：抑制赭色表型 )基因上，組裝了供插入外源 DNA片段的克隆位。 人工 酵母 染色體克隆載體的構(gòu)建 YAC(酵母人工染色體 )克隆載體是最早構(gòu)建成功的人工染色體克隆載體。 篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記； 篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型 。 第二節(jié) 酵母人工染色體載體 2022/5/25 34 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 一、 YAC載體的復(fù)制元件和標(biāo)志基因 YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的著絲粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子標(biāo)記 YAC載體的裝載量為 250 400 kb ?這樣的克隆載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制。可以接受1001000kb的外源 DNA片段。 YAC具有 自主復(fù)制序列 、 克隆位點(diǎn) 以及可在細(xì)菌和酵母菌中 選擇的標(biāo)記基因 。 現(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定， 插入的大片段外源 DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。但用 堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接； 2022/5/25 29 ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子 。 2022/5/25 28 六、 構(gòu)建 cosmid文庫應(yīng)注意哪些問題 ? ①載體分子的自身連接，從而導(dǎo)致效率降低或者失敗。 2022/5/25 27 五、 cosmid克隆載體（自學(xué) P72） ? 常用的粘性粒有 PHC7 PJB MUA3和KOSI等，它們大多具 有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)。 當(dāng)外源 DNA片段組入二聯(lián)體線形 DNA分子，并且兩個 cos位點(diǎn)之間的 DNA核苷酸序列達(dá)到足夠長時，兩個 cos位點(diǎn)可被 A蛋白切割，產(chǎn)生具有兩個 cos末端的重組 λDNA分子，就能進(jìn)行有效的體外包裝。 作為 λ噬菌體克隆載體，線形重組 λDNA分子兩端必須各有一個 cos末端。 因?yàn)?cosmid克隆載體含有 cos位點(diǎn)，可承載大的 DNA片段，進(jìn)行體外包裝后能高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞 。 四、 cosmid克隆載體的工作原理 cosmid克隆載體具有質(zhì)粒克隆載體的性質(zhì)，可以按一般質(zhì)粒克隆載體進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自行復(fù)制。
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