人工染色體載體ppt課件-閱讀頁(yè)
2025-05-17 00:10本頁(yè)面
【正文】 A著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn) 的序列，以及合適的 選擇標(biāo)記 基因。 ?這種克隆載體在體外與目的 DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體 DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。 人工染色體克隆載體的 特點(diǎn) ： 能容納長(zhǎng)達(dá) 1000 kb甚至 3000 kb的外源DNA片段。 將酵母染色體 DNA的端粒 (TEL)、 DNA復(fù)制起點(diǎn) (ARS)和著絲粒 (CEN)以及必要的選擇標(biāo)記(HISA4和 TRPl)基因序列克隆到大腸桿菌質(zhì)粒pBR322中，構(gòu)建成 YCA克隆載體。 常用的 YAC克隆載體有 3種： pYAC pYAC4和 pYAC5。 （紅色，赤紅色） 2022/5/25 40 ? 主要結(jié)構(gòu)： ①兩個(gè)可在酵母菌中利用的選擇基因， URA3和 TRP1(色氨酸合成基因 )； ②酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一個(gè)自主復(fù)制序列 (ARS1)； ④兩個(gè)來自嗜熱四膜蟲 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重復(fù)序列 (TEL)，以保持重組 YAC為線狀結(jié)構(gòu)； YAC載體 pYAC4 2022/5/25 41 ⑤ 在兩個(gè)末端序列中間，有一段填充序列 (HIS3)，以便 pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增； ⑥ Amp抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)； ⑦一個(gè) EcoRⅠ 克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵母菌 Sup4 tRNA基因內(nèi)。用電激儀把此人工染色體轉(zhuǎn)化酵母受體細(xì)胞。 pYAC4使用程序： 2022/5/25 44 ? Sup4基因編碼赭色抑制 TrptRNA，抑制赭色表型 (成為白色 )。 ? 帶有插入的外源 DNA片段的 pYAC4重組載體，其 Sup4已經(jīng)失活，結(jié)果轉(zhuǎn)化酵母菌后所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子形成赭色菌落。 ? 既能在酵母菌中復(fù)制也能在大腸桿菌中復(fù)制，所謂酵母菌 — 大腸桿菌穿梭載體。 理想的酵母表達(dá)系統(tǒng)要考慮 2022/5/25 48 釀酒酵母作表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn) ? 在 YAC載體中的插入片段會(huì)出現(xiàn)缺失和重排的現(xiàn)象。即在單個(gè) YAC中的插入片段由 2個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的基因片段連接組成的現(xiàn)象。 2022/5/25 49 細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子 F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在 50 300 kb之間。與常規(guī)克隆載體的核心區(qū)別在于其復(fù)制單元的特殊性。 2022/5/25 51 一、 BAC載體及其結(jié)構(gòu) 正常細(xì)菌人工染色體含有： ?嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)（ oriS) ?啟動(dòng) DNA復(fù)制的由 ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（ RepE) ?確保 3個(gè)低拷貝并使質(zhì)粒精確分配到子代細(xì)胞的基因座。 ?用于克隆 DNA片段體外轉(zhuǎn)錄的 SP6和 T7啟動(dòng)子。 不同的是： ?BAC載體裝載的是大片段 DNA， 一般在100Kb~300Kb 。 ?BAC載體的拷貝數(shù)小，制備難度大。 2022/5/25 56 各種類型的 pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster）結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù) 二、 BAC載體工作原理 2022/5/25 57 BAC載體 2022/5/25 58 2022/5/25 59 噬菌體 P1基本特征： 不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒 DNA分子。 * + + 構(gòu)建基因組文庫(kù) + + 構(gòu)建 DNA文庫(kù) + 常規(guī)的亞克隆化 + 構(gòu)建新型的 DNA結(jié)構(gòu) + 序列分析 + + 單鏈探針 +** + 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) + 四種常用載體的比較 * 外源 DNA如超過 10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和 DNA得率都非常低 ** 已有個(gè)別材料可用于此目的
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