人工染色體載體ppt課件-在線瀏覽
2025-06-19 00:10本頁面
【正文】 質(zhì)粒 DNA聯(lián)合組成的。 然后通過 這個(gè)位點(diǎn) ，將帶有 cos序列 、長度為 λDNA之 BglⅡ 片段 插入進(jìn)去，于是得到了 pHC79柯斯質(zhì)粒 . λDNA片段除了 cos位點(diǎn)之外，在其兩側(cè)還具有與噬菌體包裝有關(guān)的 DNA短序列； 質(zhì)粒 DNA部分則是一個(gè)完整的復(fù)制子。 三、 cosmid克隆載體的特征 ① 構(gòu)建的 cosmid克隆載體是一種環(huán)形雙鏈DNA分子， — 般在 57kb。 包括以下 4個(gè)方面 cosmid克隆載體具有質(zhì)粒的復(fù)制子，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)按質(zhì)粒復(fù)制的方式進(jìn)行復(fù)制，具有轉(zhuǎn)化大腸桿菌的功能，并且在氨芐青霉素作用下，同樣也會(huì)獲得擴(kuò)增。其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點(diǎn)。在此克隆載體上含有一個(gè) cos位點(diǎn)。 進(jìn)入寄主細(xì)胞之后的 cosmid克隆載體 DNA分子，便按照 λ噬菌體 DNA同樣的方式環(huán)化起來。 外源片段克隆在黏粒載體中是以大腸桿菌菌落的形式表現(xiàn)出來的，而不是噬菌斑。 如果 cosmid克隆載體的大小為 kb，按入噬菌體容許 包裝 的 量 計(jì)算，能承載的外源 DNA片段最大可達(dá) kb(即 51 kb～ kb)，最小的也有(即 ～ )，所以用這樣的 cosmid克隆載體能克隆 40kb左右的外源 DNA片段。 實(shí)際上，使用 cosmid克隆載體主要利用它的 λ噬菌體克隆載體性質(zhì) 。 使用 cosmid克隆載體的程序與使用 λ噬菌體克隆載體的程序有所不同 。而 cosmid克隆載體只有一個(gè) cos位點(diǎn)，因此必須先對(duì) cosmid克隆載體進(jìn)行適當(dāng)處理，構(gòu)成具有兩個(gè) cos位點(diǎn)的二聯(lián)體線形 DNA分子。 使用 cosmid克隆載體的基本程序是： 先用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割 cosmid克隆載體 具有兩個(gè) cos位點(diǎn)的二聯(lián)體線形 DNA分子 DNA連接酶 切割二聯(lián)體線形 DNA分子和部分切割待克隆的外源 DNA片段 成為可用于體外包裝的樣品 DNA連接酶 限制性核酸內(nèi)切酶 不管是 (a)程序還是 (b)程序，最后獲得的重組線形 DNA分子必須保留質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)和選擇標(biāo)記基因，保證重組的線形 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后， cos末端自行連接環(huán)化，按質(zhì)粒的性質(zhì)進(jìn)行自主復(fù)制，并且有效地表達(dá)選擇標(biāo)記基因的產(chǎn)物，供篩選陽性克隆子。 采用這種大容量載體不僅可減少構(gòu)建基因組 DNA文庫的重組克隆數(shù)目，減少工作量，提高篩選時(shí)的陽性檢出率，而且極其適合高等真核基因的克隆工作。 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的 1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn) 載體同載體自身連接 ，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。 結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來專門選出 30～45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時(shí)， 每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段 ，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度； 2022/5/25 30 ③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則 篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。 2022/5/25 31 2022/5/25 32 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。此外， YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)。 第二節(jié) 酵母人工染色體載體 2022/5/25 33 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 這種人工染色體克隆載體實(shí)際上是一種 “穿梭” 克隆載體，含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的 第一受體 (大腸桿菌 )源 質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有 第二受體 (如酵母菌 )染色體 DN
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