【正文】 用生成藍(lán)色化合物，可用比色法測(cè)定。為防止DNA酶解，提取時(shí)應(yīng)加入EDTA二鈉（乙二胺四乙酸）。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。在濃氯化鈉（1～2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，而核糖核蛋白的溶解度很小。臨用前配制，儲(chǔ)于棕色瓶中。臨用前配制，冰箱保存。臨用前取上清液。冷卻后加蒸餾水至1000ml，冷處保存（一個(gè)月內(nèi)不變質(zhì)）。5．4%維生素C溶液（已氧化變質(zhì)的維生素C不能用）。3．95%乙醇。[試劑]1．90%苯酚溶液。以2公斤家兔計(jì)，兔肝重70g左右，每實(shí)驗(yàn)室僅需1只家兔。[注意事項(xiàng)]1．在制備肝勻漿時(shí)要充分研磨，破壞肝組織。4．脫氧核糖的鑒定：取試管兩支，編號(hào)，按下表操作。3．核糖的鑒定：取試管兩支，編號(hào)，按下表操作。（三）核酸組分的定性鑒定1．磷酸的鑒定：取試管2支，編號(hào)，按下表加入試劑，搖勻，于沸水浴中2－3分鐘，觀察兩管顏色之變化。（二）核酸的水解　在核酸沉淀管內(nèi)加入5％硫酸4ml搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，即得核酸水解液。離心5分鐘后吸取全部下層液體于另一圓底離心管中。1． 再加入90%苯酚5ml，研磨10分鐘后倒入一圓底離心管中，離心5分鐘（約250r/min）。脫氧核糖 在強(qiáng)酸中加熱可生成ω羥基γ酮基戊醛，后者與二苯胺作用生成藍(lán)色化合物。3Mo2O5 鉬藍(lán)嘌呤堿 能與苦味酸作用形成針狀結(jié)晶。12MoO3 H3PO4H3PO4+12H2MoO4 H3PO4核酸（RNA，DNA）可被硫酸水解產(chǎn)生磷酸、有機(jī)堿（嘌呤和嘧啶）及戊糖（核糖或脫氧核糖）。 （周曉慧）實(shí)驗(yàn)十二 動(dòng)物肝組織中核酸的提取和鑒定[原理]動(dòng)物組織中的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。 纖維素。 11．漂洗液：量取95%乙醇45ml，加冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混勻。 8. 9. ：,巴比妥， 用蒸餾水加熱溶解后，再加蒸餾水至1000ml。 4. 飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨850g，加入1000ml蒸餾水中，在7080oC攪拌促溶，室溫放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。 2. （pH ）：取1液用蒸餾水稀釋15 倍。 ，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則DEAE纖維素會(huì)發(fā)生變質(zhì)。對(duì)照觀察血清薄膜與γ球蛋白薄膜兩者的電泳區(qū)帶分析結(jié)果。 4．電泳：將點(diǎn)樣膜條置于電泳槽上，使點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端置于陰極，槽架上用四層濾紙或兩層紗布作橋架，膜條與濾紙需貼緊，平衡約5分鐘后接通電源，調(diào)節(jié)電壓100110V，通電5060分鐘后關(guān)閉電源停止電泳。另點(diǎn)樣一條膜條，吸取少量已純化的γ球蛋白溶液滴于玻片上，其它操作同上述血清點(diǎn)樣。 ：將薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上，使膜條自然浸濕下沉，浸泡一般要大于2小時(shí)，最好過夜，充分浸透至膜上沒有白色斑痕。 （五）電泳法鑒定 1．準(zhǔn)備：在2180。 ：，（）洗滌平衡后可重復(fù)使用。 ：用pH ，流速2030滴/分，方法與上述脫鹽法相同，同樣用200g/L磺基水楊酸檢查有無蛋白流出。 ：、平衡的方法、時(shí)間同葡聚糖凝膠層析。 （三）純化 1．DEAE纖維素處理：，攪拌后放置30分鐘，加蒸餾水250ml，攪勻，待纖維素大部分下沉后，棄去含有細(xì)微顆粒的上層液體，如此反復(fù)23次，攪拌后放置30分鐘，棄取上層液體，棄上層液體后加醋酸銨溶液約200ml,用1mol/（約5ml），留待裝柱。長(zhǎng)時(shí)間不用，宜將凝膠從柱內(nèi)倒出，以濕態(tài)保存，%疊氮化鈉置4oC冰箱內(nèi)，可放置幾個(gè)月至一年，不需要干燥。6．凝膠的再生與保存：葡聚糖凝膠可柱內(nèi)再生，故凝膠層析柱可重復(fù)使用，每次用完后以醋酸銨溶液進(jìn)行充分洗滌，留待再用。每收集1ml換一試管，并不斷檢查蛋白質(zhì)，直到反應(yīng)呈陰性為止。：即樣品上柱，待層析液（醋酸銨溶液 pH ）上端的液面剛好下降至凝膠表面時(shí)（切勿進(jìn)入空氣）將凝膠層析管下端的螺旋夾擰緊，這時(shí)將鹽析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入層析柱內(nèi)，打開螺旋夾，用試管收集流出的液體，當(dāng)球蛋白溶液恰好完全進(jìn)入凝膠柱上端面內(nèi)時(shí)，立即用2ml醋酸銨溶液小心沖洗管壁上的蛋白質(zhì)，然后再重復(fù)沖洗一次。：用螺旋夾控制流速810滴/分，用醋酸銨溶液（ ）流洗平衡幾分鐘后，即可使用。20cm 或25ml堿式滴定管），垂直夾于鐵架臺(tái)上，關(guān)閉玻管出口，先加入醋酸銨溶液約10ml,打開出口讓硫酸銨溶液充滿下部容器然后排出，以排除空氣。輕攪拌片刻，待大部分凝膠下沉后，棄去含有細(xì)微顆粒的上清液，再加醋酸銨溶液100ml重復(fù)處理一次，最后加入醋酸銨溶液20ml，此即為已溶脹備用的凝膠溶液。冷卻置室溫，待凝膠大部下沉后，棄去含有細(xì)微懸浮凝膠顆粒的上清液。振搖使之溶解，此液即為粗提的球蛋白溶液。 [操作]（一）鹽析粗提：，使之成為半飽和溶液。上清液即為濃縮的γ球蛋白溶液。 利用葡聚糖凝膠G25型干膠吸水膨脹，而不吸入蛋白質(zhì)的特性，在已純化的γ球蛋白溶液中加入適量葡聚糖凝膠G25型干膠。 （四）濃縮干燥的葡聚糖凝膠顆粒內(nèi)部有孔隙容積。DEAE纖維素是一種陰離子交換樹脂，本身帶有正電荷，可與溶液中帶負(fù)電荷的離子結(jié)合，如α球蛋白、β球蛋白等。本實(shí)驗(yàn)采用DEAE纖維素［二乙基氨乙基，CH2CH2N+H（CH2CH3）2 ］離子交換層析法進(jìn)一步純化g球蛋白。結(jié)果大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)）直徑大，不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，垂直向下移動(dòng)，速度快。凝膠過濾層析法主要根據(jù)混合物中分子大小不同的各種物質(zhì)，隨流動(dòng)相流經(jīng)作為固定相的凝膠層析柱時(shí)，各種物質(zhì)分子擴(kuò)散移動(dòng)速度不同使混合物中各種物質(zhì)得到分離的技術(shù)。 （二）凝膠過濾層析法脫鹽用鹽析法分離而得到的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化，因此必須首先去除。由于各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度不一，調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀析出，達(dá)到分離目的。過程包括：鹽析、離心分離、凝膠層析、離子交換層析純化、濃縮和電泳鑒定等幾個(gè)步驟。分離蛋白質(zhì)常用的方法有：鹽析、層析、超離心、超過濾等，根據(jù)目的要求不同，可分別采用這些方法或幾種方法配合使用。 4．。 2，氨基黑10B染色液：氨基黑10B 、甲醇50 ml、冰醋酸10 ml、蒸餾水40 ml。腎病綜合征時(shí)，白蛋白降低，αβ球蛋白升高。 [計(jì)算 ] 光密度總和T=A+α1+α2+β+γ 各部分蛋白質(zhì)的構(gòu)成比為： 白蛋白=A/T；α1球蛋白=α1/T：依次類推。（2）剪開薄膜上各條蛋白色帶，另于空白部位剪—平均六小的薄牽，分別浸入上述試管內(nèi)，不時(shí)搖動(dòng)，使藍(lán)色洗出。用濾紙吸干薄膜。槽架上四層紗布怍橋墊，膜條與紗布需貼緊，待平衡5分鐘后通電，調(diào)節(jié)電壓至90V，～，通電1小時(shí)左右關(guān)閉電源。 (4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加樣器的鋼口蘸取樣品，平直印于膜上，待血清全部滲入膜內(nèi)，移開點(diǎn)樣器。 （2）將薄膜無光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液中(緩沖液盛于培養(yǎng)皿中)。固定染色之后，不僅可看到清晰的色帶，并可將各帶染料溶于堿溶液中進(jìn)行定量測(cè)定，從而計(jì)算出血清中各種蛋白質(zhì)的構(gòu)成比。 醋酸纖維薄膜作為電泳支持物具有電滲小、分離速度快，區(qū)帶清晰、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。血紅蛋白回收率（％）＝洗脫收集液光密度值／上柱前液光密度值 100％[試劑]1． Sephadex G502． 草酸鉀抗凝血液3． ％NaCl4． 魚精蛋白5． 10％NaHCO36． 2，4二硝基氟苯7． 95％乙醇（王魯華）實(shí)驗(yàn)九 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 [原理] 血漿中的各種蛋白質(zhì)，它們都解離成負(fù)離子，向正極移動(dòng)。[結(jié)果與計(jì)算]，加蒸餾水至5ml作為標(biāo)準(zhǔn)管（上柱前液），取收集的血紅蛋白液加蒸餾水至5ml。5．洗脫與收集反復(fù)加入蒸餾水洗脫，調(diào)節(jié)出口處螺旋夾，～／分左右（約10～15滴／分）洗脫時(shí)可觀察到黃、紅兩條區(qū)帶逐漸分開，當(dāng)紅色的血紅蛋白區(qū)帶到達(dá)玻管下端時(shí)，用帶刻度的離心管收集流出液，直至紅色液全部流出為止，待測(cè)。4．加樣加樣時(shí)先將層析管出口打開，使床表面蒸餾水流出，直到床面正好露出，用下口較大的滴管，將上述樣品（）緩緩沿層析柱內(nèi)壁小心地加于床表面，注意盡量不使床面攪動(dòng)，然后打開出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直到床面重新露出，重復(fù)上法加1～2倍于樣品體積的蒸餾水，這樣可使樣品的稀釋最小，而樣品又完全進(jìn)入床內(nèi)。離心5分鐘，棄去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸餾水溶解，即為DNP魚精蛋白溶液，備用。溶于微熱的95％乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即傾入上述蛋白質(zhì)溶液中。加蒸餾水5ml，充分混勻，放冰箱過夜使沉淀的血球充分溶血，備用。如層析床凝膠表面不平整，可在凝膠表面用細(xì)玻棒輕輕攪動(dòng)，再讓凝膠自然沉降，使表面平整。然后關(guān)閉玻管的出口，邊輕輕攪拌以蒸餾水稀釋的葡聚糖凝膠懸浮液，邊將其自層析管頂部緩緩加入，待底部凝膠沉積1～2cm時(shí)，再打開出口，一面繼續(xù)加凝膠，待凝膠上升至距玻管頂3cm左右即可停止，最后以蒸餾水平衡凝膠柱。[操作]1．凝膠的制備稱取Sephadex G50 1g，置于錐形瓶中，加蒸餾水30ml，于沸水浴中煮沸1小時(shí)（此為加熱法溶脹，如在室溫溶脹，需浸泡3小時(shí)），取出冷卻至室溫后再行裝柱。（王魯華）實(shí)驗(yàn)八 凝膠過濾層析分離血紅蛋白與魚精蛋白[原理]本試驗(yàn)使用交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G50）將血紅蛋白（紅色，分子量為64500）與二硝基氟苯魚精蛋白，從混合液中分開。5． 檸檬酸鈉。3． 生理鹽水。[試劑]1． 葡聚糖凝膠G25。（3）用上述方法加入約2ml蒸餾水。4．加樣：（1）將層析柱出口打開，使床表面的蒸餾水流出，直到床面正好露出，再關(guān)閉出口。之后把硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉碳酸鈉溶液中。（Na2CO3將血細(xì)胞用5倍體積蒸餾水稀釋。當(dāng)凝膠上升至距柱頂3cm時(shí)即可。然后自頂部緩緩加入葡聚糖凝膠G25懸液。[操作]1．凝膠的準(zhǔn)備：葡聚糖凝膠G25 1g，置于錐形瓶中，加蒸餾水30ml，于沸水浴中煮沸2小時(shí)（或在室溫放置6小時(shí)），待冷卻至室溫時(shí)裝柱。 2. % NaCl溶液。 2．樣品測(cè)定：%NaCl溶液稀釋，使其濃度在蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，混勻后按上述方法測(cè)定光密度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出樣品的蛋白濃度。如果A280/A260≥，可忽略不計(jì)核酸的影響，A280/A260，需按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）= [操作] 1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 取試管8支按下表加入試劑試 劑（ml）12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（1mg/ml）%NaCl溶液蛋白濃度(mg/ml)混勻，選波長(zhǎng)280nm，用1cm石英比色杯，第一管為空白，分別測(cè)定各管溶液光密度值。蛋白質(zhì)樣品中含有核酸時(shí)，混雜的核酸在280nm處也有吸收，對(duì)此法有一定的影響。對(duì)于同樣濃度的不同蛋白質(zhì)，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，選用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)時(shí)必須注意。 （2）稱取Na2WO42H2O 100g及Na2MoO42H2O 25g溶于700ml蒸餾水中，加入85% H3PO4 50ml，濃HCl 100ml混勻后，置圓底燒瓶中回流10小時(shí)，加入硫酸鋰（Li2SO4H2O）150g、蒸餾水50ml及濃溴水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)煮沸15分鐘去溴，冷卻后稀釋至1000ml，過濾，溶液應(yīng)為金黃色，置棕色瓶中保存，使用時(shí)稀釋至1mol/L。 3．試劑B：2g酒石酸鉀鈉及1g CuSO45H2O分別溶解于少量水中，混合后加蒸餾水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。[試劑] ：稱量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙種球蛋白10mg，用生理鹽水配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。[注意事項(xiàng)] ～。C水浴箱保溫10分鐘，冷卻后在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)650nm比色讀取光密度值。（二）樣品測(cè)定 取試管2支，按下表加入試劑試 劑（ml）測(cè)定管空白管稀釋的待測(cè)樣品生理鹽水試劑A 混勻后在50176。冷卻后以1號(hào)管為空白，在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)650nm比色，讀取光密度值。C水浴10分鐘，冷卻后各管加入試劑B ，室溫放置10分鐘，各管加入試劑C 3ml，立即混勻，置37176。利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比的關(guān)系可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。另取酒石酸鉀鈉10g、碘化鉀5g，溶于500毫升蒸餾水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后將硫酸銅溶液傾入，加蒸餾水至1000 ml。 [試劑] 1．10g/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱式定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理鹽水配成濃度為10mg /ml。以各管的光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)含有肽鍵，因而一切蛋白質(zhì)均可與雙縮尿試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，且顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，經(jīng)與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液相比，即可求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 故：﹕28=﹕X X=1 7．硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液： ，于100毫升容量瓶中，以蒸餾水稀釋至刻度，于帶磨口玻璃瓶中保