培訓(xùn)講義-修改后-文庫吧資料
2025-04-22 22:38本頁面
【正文】 4000rpm離心收集菌體再涂到平板上。3. 加500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm 培養(yǎng)60min。2. 42℃熱擊90s（注：應(yīng)在冰浴時先打開水浴鍋，使溫度升到42℃）。三、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌【實驗步驟】1. 從70℃冰箱中取出一管感受態(tài)細(xì)胞，加入1~20ul質(zhì)粒（或連接產(chǎn)物），冰浴30min。【主要試劑】 CaCl2 CaCl2溶解于80ml蒸餾水中，加蒸餾水定容至100ml，高溫滅菌。 CaCl2（含甘油）溶液1mL懸浮細(xì)胞。 CaCl2 溶液10mL懸浮沉淀，冰浴30min。4. 4℃，4000rpm離心10min，回收細(xì)胞，棄上清（倒去液體）。2. 取500ul過夜培養(yǎng)的菌液加入50mlLB培養(yǎng)基（按照1:100的比例），37℃/200rpm培養(yǎng)34hr,經(jīng)分光光度計測量，~。分裝于離心管中，20℃保存。分裝于離心管中，20℃保存。分裝于離心管中，20℃保存。分裝于離心管中，20℃保存?！局饕噭縇B（250mL）液體培養(yǎng)基： 固體培養(yǎng)基（添加瓊脂）NaCl NaCl 胰蛋白胨 胰蛋白胨 酵母提取物 酵母提取物 瓊脂 120℃滅菌20min。每次劃線后要燒接種環(huán)（或更換槍頭），再從上一次劃痕的尾部拉出后劃下一區(qū)。3. 劃線。倒入玻璃或可高溫滅菌的塑料平板中。將所用物品放入超凈臺中超凈工作臺滅菌（打開紫外燈，照射15 min，完畢后打開風(fēng)機吹5min）。配制實驗中所使用的各種抗生素（），將玻璃培養(yǎng)皿或可滅菌的塑料培養(yǎng)皿高溫滅菌（同上）。如果提取的RNA完整度好，28S亮度應(yīng)該是18S的兩倍以上，這兩條帶清晰，帶的邊緣可見。5. DEPC水的配置：須在通風(fēng)廚里帶手套操作。3. 做試驗的桌面要用1N/L的HCl擦拭，后再用70%乙醇擦拭晾干。所需要的離心管、槍頭等都需要用1%的DEPC水處理過夜，然后高壓滅菌。（OD260/OD280）：紫外分光光度計進行測量（選擇正確的稀釋倍數(shù)，確保OD260 ~，通常離心柱法稀釋10倍左右； 溶液裂解法稀釋40－50倍）OD260/OD280 ～；OD260/OD280 = ～；OD260/OD280 ～；濃度：用ND1000分光光度計測量，重復(fù)兩次。加入甲醛凝膠加樣緩沖液2ul。凝膠制備RNA甲醛變性凝膠濃度通常為1—%。高壓滅菌，室溫保存于棕色瓶子中（光照或高壓滅菌后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然）。注：RNA溶解時不要晾太干，會導(dǎo)致難以溶解?！局饕噭?M GT溶液：4M GT異硫氫酸胍（Guanidine thiocyanate），25m M 檸檬酸鈉（Sodium citrate），%(w/v) 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)，高壓滅菌之后，（體積比大約為：%）2M NaAC（）3M NaAC4M LiCLDEPC H2O{v/v % DEPC處理的ddH2O（37℃處理12h以上，處理過程要不斷攪拌，高溫高壓滅菌去除殘留）} 或TE。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中）。缺點：%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。酸酚使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離，又對RNA酶有強烈的變性作用。RNA可直接用于Northern分析，Poly（A）分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆等。Trizol法適用于動物、植物和微生物組織，樣品量從幾十毫克至幾克。（1）苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；（2）鹽酸胍法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和β巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀；（3）氯化鋰沉淀法：因為鋰在在一定pH下能使RNA相對特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northern blot試驗。rRNA含量最豐富，由25S、18S和5S幾類組成。2ng/ul；若樣品DNA濃度100ng/ul，兩次重復(fù)差值≤2%。8. ND1000分光光度計測量DNA濃度，重復(fù)兩次。DNA溶解后，輕緩晃動離心管，若溶液中有氣泡，表明DNA濃度過高，需再加入適量TE緩沖液。5. 鉤出DNA時，動作要輕緩，洗滌后要除盡乙醇。3. CTAB緩沖液裂解溫度一般為65℃，孵育結(jié)束后，應(yīng)徹底冷卻至室溫，該步驟可持續(xù)12h。OD230/OD260 ～OD260/OD280 =～OD260/OD280 OD260/OD280 【注意事項】1. 研磨前，研缽、離心管、藥勺等物品均需用液氮預(yù)冷徹底，研磨過程應(yīng)保證樣品不融化，研磨應(yīng)足夠細(xì)。DNA樣品應(yīng)有唯一性編號，并與原始樣品相對應(yīng)。11. DNA溶解完全后。相同樣品可合并。10. 每1ml樣品加入100250ul TE緩沖液溶解DNA。9. 干燥DNA?？蛇x：重復(fù)步驟（2）1次。（1）2025℃，5100g離心57m
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