培訓(xùn)講義-修改后-展示頁
2025-04-25 22:38本頁面
【正文】 in，棄上清。可選：接步驟（3），以相同速度離心12min，用吸頭吸盡乙醇。（3） 2025℃，13000rpm（）或5100g（50ml管）離心57min，棄上清。（2） 將DNA（可將多個樣品的DNA合并成一管）加入70%乙醇溶液中。方法1：鉤出DNA。7. 加入等體積的無水乙醇，輕緩顛倒混勻，直到沉淀出現(xiàn)。6. 加入等體積氯仿，重復(fù)步驟4和5。顛倒混勻23min?？蛇x：2025℃，3000g離心3min，轉(zhuǎn)移上清液到新管中。2. 每1克樣品加入5ml CTAB提取緩沖液和2550ug RNase A（可選），顛倒混勻，6070℃水浴孵育4050min，期間混勻23次。室溫保存，五年有效。室溫保存，五年有效。3. 無水乙醇：20℃保存，五年有效。室溫保存，五年有效。 【實驗?zāi)康摹坷肅TAB法從植物葉片組織中提取高質(zhì)量DNA。 CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后，加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。實驗一 植物核酸提取一、植物葉片總DNA的大量提取【實驗原理】CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中()，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。TrisHCl ()提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解在液相中；【主要試劑】1. CTAB提取緩沖液： NaCl，100mM Tris pH ，2% CTAB，20mM EDTA，% NaHSO3，2% β巰基乙醇。2. 氯仿：室溫保存，五年有效。4. 70%乙醇溶液：將無水乙醇和H2O按7:3混合。5. TE 緩沖液（250ml）： 1 M TrisHCl，（10mM）； EDTA，（1mM）；加H2O至250ml。【操作步驟】1. 在液氮中將葉片研磨粉碎，取14克樣品于合適的離心管中（初始樣品為1克，用13ml管；初始樣品1克，用50ml管）。3. 從水浴中取出樣品，冷卻至室溫。4. 每1克樣品加入5ml氯仿。5. 2025℃，10300g離心810min，轉(zhuǎn)移上清液到新管中。可選：步驟4和5可重復(fù)多次，直到獲得澄清的上清液。8. 沉淀DNA。（1） 用接種環(huán)鉤出DNA（可選：1000g離心1min，富集DNA）。初始樣品為1ml， 70%；初始樣品1ml，加入裝有1012ml 70%乙醇的50ml離心管。可選：用上述相同體積的70%乙醇重復(fù)洗滌DNA沉淀1次。方法2：離心沉淀DNA。（2）加入56ml（13ml管）或1012ml（50ml管）70%乙醇溶液洗滌DNA沉淀，2025℃，5100g離心57min，棄上清?？蛇x：接步驟（2），以相同速度離心12min，用吸頭吸盡乙醇。真空干燥≤10min，空氣干燥≤1h（30min左右），DNA過度干燥會導(dǎo)致難以溶解。也可適當(dāng)增加TE緩沖液用量，或?qū)NA溶液置于70℃孵育14h，促進(jìn)DNA溶解?？?℃過夜溶解。測定DNA濃度后，根據(jù)需要，將DNA溶液分裝（每管分裝1個酶切體系所需DNA量，10ug/管），保存于4℃、20℃或80℃冰箱。12. %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度，ND1000分光光度計測量DNA濃度。2. 提取過程中，應(yīng)采用顛倒混勻方式，而不能渦旋混勻，所有過程保證離心管蓋蓋好，防止液體漏出。4. 加入氯仿后，應(yīng)徹底混勻23min。6. TE緩沖液適用于基因組DNA、質(zhì)粒DNA長期保存，ddH2O適用于短期保存。7. 測定DNA溶液濃度前，應(yīng)用吸頭混勻溶液。若樣品DNA濃度為2100ng/ul，兩次重復(fù)差值≤177?！緟⒖茧娪緢D片】完整度好時電泳帶型：單一無拖尾，點樣孔無殘留雜質(zhì)如下圖：提取效果不好如下圖：RNA殘留蛋白殘留拖尾降解 二、植物葉片總RNA的大量提取【實驗原理】植物細(xì)胞內(nèi)的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。mRNA種類繁多，分子量從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但絕大多數(shù)mRNA在3’端都有一個polyA尾巴，因此，可根據(jù)此特性用寡聚脫氧胸苷(OligodT)層析柱從總RNA中將 mRNA分離出來。已有多種較為成熟的分離總RNA的方法，常用的有3種。采用Trizol 試劑盒提取總RNA，其原理是依據(jù)鹽酸胍法。用Trizol 法提取的總RNA絕無蛋白和DNA 污染。異硫氫酸胍：有效地RNAse抑制劑。β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除；NaAc，Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少RNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與核酸聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面
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