培訓(xùn)講義-修改后-閱讀頁(yè)
2025-05-01 22:38本頁(yè)面
【正文】 2. TBE中，加熱混勻，配成1%瓊脂糖凝膠；3. 粘膠帶，插梳子；4. 凝膠冷卻至60℃，搖勻后倒入電泳槽。雙手均衡用力取下梳子，動(dòng)作要慢；5. TBE 倒入電泳槽中，約超過(guò)膠面1cm（開始可略少，以便于點(diǎn)樣）；6. 取一塊封口膜，將溴酚藍(lán)點(diǎn)于其上，取5uL待點(diǎn)樣品同溴酚藍(lán)混勻。8. 連接電源?！局饕噭?．10x TBE 電泳緩沖液 ，20mL （），加水定容至100mL 2．6x 上樣緩沖液 %溴酚藍(lán)，%二甲苯青FF，15%聚蔗糖水溶液，室溫保存。也可將菌種按照1:100的比例進(jìn)行接種。吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。（上下顛倒混勻，可稍用力輕彈，此時(shí)配溶液II，并冰浴溶液III）4. 加200μL溶液II（新鮮配制），蓋緊管口，混勻內(nèi)容物，冰上放置至澄清，該過(guò)程不能超過(guò)5min。該過(guò)程動(dòng)作務(wù)必輕柔。6. 4℃/12000rpm 離心5min，取上清移至另一離心管中。8. 向上清中加入2倍體積無(wú)水乙醇和1/10體積的3M NaAc（pH ），混勻后，冰浴10分鐘，4℃/12000rpm 離心5min，棄上清，倒置離心管于濾紙上。10. 待酒精揮發(fā)干凈后，加20μL TE緩沖液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，放在37℃水浴中保溫1h，使DNA完全溶解，20℃保存。Cl緩沖液（1L）pH Tris溶于800mL水中，攪拌條件下加入濃鹽酸（pH 70mL；pH ，pH ），溶液冷卻至室溫，加入重蒸水至總體積1L，分裝，高壓滅菌。Cl溶液的pH值隨溫度變化而變化，溫度每升高1℃，配置及使用時(shí)需注意。2H2O ，加入800mL重蒸水，磁力攪拌器攪拌，加入NaOH調(diào)至pH ，用重蒸水定容至1L。2H2O才能完全溶解。）3. I號(hào)液（100mL） 、 1M Tris4. II號(hào)液（不滅菌） NaOH（100mL）和2%SDS等體積混合，新鮮配制。B、2%SDS（50mL）：稱取2g SDS，dH2O定容至100mL。6. 10mg/mL 溶菌酶 + 1mL無(wú)菌水 + 10μL 1M TrisCl 1mL + EDTA ，加dH2O定容至100mL。3H2O溶于80mL dH2O中，（），定容100ml，高壓滅菌。Cl10. 胰RNA酶（20μg/mL）2μL胰RNA酶原液 + 1mL TE，分裝七、 質(zhì)粒的酶切鑒定【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 按如下表所示向離心管中添加藥品：10uL的反應(yīng)體系20uL的反應(yīng)體系10x buffer 1uL限制性內(nèi)切酶 DNA ddH2O 8ul10x buffer 2uL限制性內(nèi)切酶 1uLDNA 1uLddH2O 16ul2. 37℃（或其他酶的最適溫度）孵育14小時(shí)。實(shí)驗(yàn)三 植物組織培養(yǎng)相關(guān)操作【相關(guān)名詞】外植體：在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)對(duì)象的起始材料。無(wú)菌操作：在整個(gè)操作的進(jìn)行過(guò)程中，材料所處的環(huán)境、所使用的試劑、器皿、器具都是無(wú)菌的，這樣的操作過(guò)程稱為無(wú)菌操作。繼代培養(yǎng)：把培養(yǎng)材料接種到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)?！局参锊牧稀?紫花苜蓿無(wú)菌苗。 溫室栽培的紫薯。 器具：移液器（吸頭）、鑷子、手術(shù)剪、手術(shù)刀（刀柄、刀片）。 其他：封口膜、酒精棉、濾紙等。待其溶解后，定容到1L，并用1N NaOH和1N 。MB培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基粉末和30g 蔗糖，加入裝有900ml 蒸餾水的1L三角燒瓶中，加入攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌。調(diào)好pH值后，加入8g 瓊脂粉，用封口膜封號(hào)瓶口，等待滅菌。% HgCl2：稱取1g HgCl2，在三角燒瓶?jī)?nèi)溶于1L 蒸餾水中，用封口膜封號(hào)瓶口，等待滅菌?！静僮鞑襟E】（一） 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 培養(yǎng)基滅菌 把高壓蒸汽滅菌鍋電源接通，確認(rèn)鍋內(nèi)的水處于高水位；把培養(yǎng)基以及所有需要滅菌的試劑放入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，設(shè)定滅菌時(shí)間（20min）、溫度（121℃），打開氣閥，開始滅菌。滅菌時(shí)間到后，小心打開氣閥，緩慢放氣。 超凈工作臺(tái)消毒把超凈工作臺(tái)內(nèi)的干熱滅菌器電源打開（如果不用，則不用打開），把培養(yǎng)瓶/皿（或培養(yǎng)基）放入超凈臺(tái)內(nèi)，打開超凈臺(tái)紫外燈，消毒20~30min。注意：以下的操作（除紫薯藤條的沖洗外）均為無(wú)菌操作，在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作前，應(yīng)先用酒精棉把手擦凈，進(jìn)行表面消毒后方可進(jìn)行。每升培養(yǎng)基可以倒20瓶/皿。把裝有紫花苜蓿無(wú)菌苗的培養(yǎng)瓶的外部用酒精棉擦凈，打開蓋子，用剪刀把紫花苜蓿齊根部剪斷，用鑷子取出，放到潤(rùn)濕的濾紙上。每瓶接種4~6段。（三） 煙草葉片的再生誘導(dǎo)把干熱滅菌器中的手術(shù)剪、鑷子和手術(shù)刀取出，晾涼備用；用少量無(wú)菌水玻璃培養(yǎng)皿的濾紙濕潤(rùn)備用。用鑷子固定住葉片，用手術(shù)刀小心把主葉脈去除。放到光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。1. 紫薯藤條的表面消毒：將溫室中剪下的紫薯藤條用自來(lái)水洗凈，并用吸水紙吸干（超凈工作臺(tái)外操作）。倒掉酒精，% HgCl2溶液至浸沒(méi)，消毒8min，期間鑷子把藤條晃動(dòng)數(shù)次。重復(fù)漂洗三次。用鑷子把莖段接到塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的MSO培養(yǎng)基上（生理下端插入培養(yǎng)基內(nèi)），蓋上瓶蓋。新接種的瓶子做好標(biāo)記，放到光照培養(yǎng)室
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