培訓(xùn)講義-修改后-免費(fèi)閱讀
【正文】 用鑷子把莖段接到塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)的MSO培養(yǎng)基上（生理下端插入培養(yǎng)基內(nèi)），蓋上瓶蓋。放到光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。把裝有紫花苜蓿無菌苗的培養(yǎng)瓶的外部用酒精棉擦凈，打開蓋子，用剪刀把紫花苜蓿齊根部剪斷，用鑷子取出，放到潤濕的濾紙上。滅菌時(shí)間到后，小心打開氣閥，緩慢放氣。MB培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基粉末和30g 蔗糖，加入裝有900ml 蒸餾水的1L三角燒瓶中，加入攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌。 溫室栽培的紫薯。實(shí)驗(yàn)三 植物組織培養(yǎng)相關(guān)操作【相關(guān)名詞】外植體：在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)對象的起始材料。6. 10mg/mL 溶菌酶 + 1mL無菌水 + 10μL 1M Tris2H2O才能完全溶解。10. 待酒精揮發(fā)干凈后，加20μL TE緩沖液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，放在37℃水浴中保溫1h，使DNA完全溶解，20℃保存。（上下顛倒混勻，可稍用力輕彈，此時(shí)配溶液II，并冰浴溶液III）4. 加200μL溶液II（新鮮配制），蓋緊管口，混勻內(nèi)容物，冰上放置至澄清，該過程不能超過5min。8. 連接電源。（注：涂菌器沾酒精反復(fù)燒三次，以消毒滅菌）5. 37℃倒置過夜。 CaCl2（含甘油） CaCl2溶解于80ml蒸餾水中，再添加15ml甘油，最后加蒸餾水定容至100ml，高溫滅菌。3. 將菌液倒入50mL離心管中，冰浴10min（同時(shí)冰浴CaCl2溶液）。 Kan50（50mg/ml）稱取5g卡納霉素，溶于100ml水中。溫度與速度都很重要，因?yàn)楦邷厥箍股厥?，且培養(yǎng)基中瓊脂含量較高，易凝固而無法使抗生素混勻，且不易全部倒出?！緟⒖茧娪緢D片】Marker（天根 Marker III）：200，500，800，1200，2000，3000，4500，紅色箭頭是28s片段，白色箭頭是18s片段。（5）電泳過程A. 先將凝膠放入1X 甲醛凝膠電泳液中100V預(yù)電泳5—30分鐘；B. 點(diǎn)樣，100V電泳45—60分鐘；C. 照相?！静僮鞑襟E】1. 植物組織1g，液氮研磨；2. 倒入50ml離心管中（管中事先放3ml的4M GT，冰浴），震蕩混勻；3. 2M 的NaAC，震蕩混勻；4. 加入3ml酸酚（水飽和酚＋%(w/v)δ羥基喹啉δHydroxyquinoline），震蕩混勻；5. 加入1ml氯仿，震蕩混勻，6000rpm，13min，取上清；6. 加入2倍體積的乙醇，20度過夜（幾小時(shí)也可以，產(chǎn)量可能會(huì)低）；6000rpm，離心10min，棄上清，留沉淀；7. 加入1ml 4M的LiCL（）；13000rpm，1015min，留沉淀；8. ，溶解；9. 加入1/2體積的酸酚和1/2的氯仿，震蕩混勻；10. 13000rpm，離心5min，取上清液；11. 加入1倍體積的氯仿；13000rpm，離心5min，取上清液；12. NaAC和2倍體積乙醇；震蕩混勻，20度過夜；13. 13000rpm，離心5min，留沉淀；14. 沉淀RNA晾干，DEPC水或TE溶解（40—60ul）。用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與核酸聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。采用Trizol 試劑盒提取總RNA，其原理是依據(jù)鹽酸胍法。若樣品DNA濃度為2100ng/ul，兩次重復(fù)差值≤177。2. 提取過程中，應(yīng)采用顛倒混勻方式，而不能渦旋混勻，所有過程保證離心管蓋蓋好，防止液體漏出。也可適當(dāng)增加TE緩沖液用量，或?qū)NA溶液置于70℃孵育14h，促進(jìn)DNA溶解。方法2：離心沉淀DNA。8. 沉淀DNA。3. 從水浴中取出樣品，冷卻至室溫。2. 氯仿：室溫保存，五年有效。在高離子強(qiáng)度的溶液中()，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹坷肅TAB法從植物葉片組織中提取高質(zhì)量DNA。室溫保存，五年有效。6. 加入等體積氯仿，重復(fù)步驟4和5。（3） 2025℃，13000rpm（）或5100g（50ml管）離心57min，棄上清。9. 干燥DNA。DNA樣品應(yīng)有唯一性編號，并與原始樣品相對應(yīng)。DNA溶解后，輕緩晃動(dòng)離心管，若溶液中有氣泡，表明DNA濃度過高，需再加入適量TE緩沖液。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northern blot試驗(yàn)。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中）。凝膠制備RNA甲醛變性凝膠濃度通常為1—%。3. 做試驗(yàn)的桌面要用1N/L的HCl擦拭，后再用70%乙醇擦拭晾干。將所用物品放入超凈臺(tái)中超凈工作臺(tái)滅菌（打開紫外燈，照射15 min，完畢后打開風(fēng)機(jī)吹5min）?！局饕噭縇B（250mL）液體培養(yǎng)基： 固體培養(yǎng)基（添加瓊脂）NaCl NaCl 胰蛋白胨 胰蛋白胨 酵母提取物 酵母提取物 瓊脂 120℃滅菌20min。分裝于離心管中，20℃保存。 CaCl2（含甘油）溶液1mL懸浮細(xì)胞。3. 加500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm 培養(yǎng)60min。20分鐘
教學(xué)教案相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1