【正文】 “ 內(nèi)濾作用 ” 2022/4/14 （ 4） 氧的猝滅作用 ? O2可以說是熒光和磷光的最普遍存在的猝滅劑。因此不同酸度下，熒光光譜和熒光強度都可能發(fā)生變化 ? 在熒光分析中一般都要較嚴格地控制溶液的 pH值 2022/4/14 2022/4/14 7． 形成氫鍵的影響 ? 熒光物質(zhì)與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子所形成的分子間氫鍵可能有兩種情況 ? 一種是在激發(fā)之前熒光體的基態(tài)所形成的氫鍵，這種情況一般使摩爾吸光系數(shù)增大，即吸收增強，因此熒光強度增大，同時也可能發(fā)生分子極性及共軛程度的變化。 當激發(fā)態(tài)分子接受到額外熱能而沿激發(fā)位能曲線AC移動至交點 C時，有可能轉(zhuǎn)換至基態(tài)的位能曲線 NC， 使激發(fā)轉(zhuǎn)化為基態(tài)的振動能，隨后通過振動弛豫而喪失振動能量 2022/4/14 6. 溶液 pH值對熒光強度的影響 ? 帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的 pH有關(guān) ? 金屬離子與有機試劑形成的發(fā)光螯合物也受到溶液 pH值的影響。 溫度上升 ， 熒光強度下降 (這是因為分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用和溶液溫度上升時介質(zhì)的粘度降低 ， 熒光物質(zhì)與溶劑分子的碰撞也隨之增加 ) ? 熒光分析時一定要控制好溫度 ? 低溫熒光可以提高靈敏度 ， 已發(fā)展為熒光分析中的一個重要分支 2022/4/14 不同溫度下鄰菲羅 啉的熒光光譜 2022/4/14 ? 溶液不存在猝滅劑時，熒光的量子產(chǎn)率與去激化的輻射躍遷過程及非輻射躍遷過程的相對速率有關(guān) ? 一般認為輻射過程速度不隨溫度變化，因此，熒光量子產(chǎn)率的變化反映了非輻射躍遷過程速率的變化 2022/4/14 ? 隨著溶液溫度的升高，介質(zhì)粘度降低，分子運動速度也變大，從而使熒光分子與溶劑分子或其它分子的碰撞機率增加，外部能量轉(zhuǎn)移速率變化。由于溶質(zhì)分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜可能會有顯著不同 2022/4/14 ? 有時，增大溶劑的極性，將使 n→π* 躍遷的能量增大， π→π* 躍遷的能量減小，而導(dǎo)致熒光增強，熒光峰紅移 如 8巰基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四種不同極性的溶劑中熒光峰和熒光強度（熒光效率）分別為：390nm（ ）， 398nm（ ），405nm（ ） 和 410nm（ ） 2022/4/14 ? 但也有相反的情況 如苯氨萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五種醇中隨著醇的極性增大，熒光強度減小，熒光峰藍移 2022/4/14 ? 如果溶劑和熒光物質(zhì)形成了化合物或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)或存在型體改變 ， 則熒光峰位置和強度都會發(fā)生較大的改變 ? 如果溶液分子與熒光物質(zhì)形成氫鍵 ， 將使熒光峰明顯紅移 ， 熒光強度一般增大 2022/4/14 ? 在含有重原子的溶劑（如溴化正丙酯等）中，一般也使熒光體的熒光強度降低，而使磷光強度升高，這種現(xiàn)象稱為“ 外重原子效應(yīng) ” ? 溶劑中重原子的高核電荷引起溶質(zhì)分子的自旋與軌道之間強烈的偶合作用，結(jié)果使 S1→T 1 的系間的跨躍、磷光發(fā)射及 T1→ S 0的系間跨躍等過程的幾率增大。也會發(fā)生 d→d* 或 f→f* 的發(fā)光躍遷，但躍遷機率很小，吸光及發(fā)光很弱 ? 當與配位體螯合時，則首先是發(fā)生配位體的 π→π* 吸收躍遷，而金屬離子的 d*或 f* 能層在配位體激發(fā)后最低激發(fā)單重態(tài) S1能層的下方，因而可以發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，由 S1轉(zhuǎn)移給 d*或 f* ，然后發(fā)生 d→d* 或 f→f* 躍遷，使躍遷機率增大，發(fā)光強度增大 2022/4/14 4. 溶劑的影響 ? 一般溶劑效應(yīng)： 指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響 ， 該效應(yīng)是普遍的 。但令人費解的是硝基苯的磷光也很弱，普遍認為可能產(chǎn)生比磷光速率更快的非輻射S1→T 1 的系間跨躍，或發(fā)生光化學反應(yīng) ? 和給電子基團一樣，吸電子基團也都存在 n電子，所以對極性溶劑及酸、堿介質(zhì)都較為敏感 2022/4/14 ★ 取代基位置的影響 ? 取代基位置對芳烴熒光的影響通常為：鄰位、對位取代者增強熒光，間位取代者抑制熒光 (－ CN取代者例外 ) 2022/4/14 ★ 取代基的空間阻礙對熒光也有明顯的影響 2022/4/14 ? 萘環(huán)上的 8位引入－ SO3－ 基時，由于空間阻礙使－ NR2與萘之間的鍵扭轉(zhuǎn)而減弱了平面構(gòu)型，影響了情況 p～ π共軛，導(dǎo)致熒光的減弱 ? 同樣， 1， 2－二苯乙烯的反式異構(gòu)體是強熒光物質(zhì)，而順式異構(gòu)體不發(fā)射熒光 2022/4/14 ★ 熒光體取代上重原子后，熒光減弱，而磷光往往相應(yīng)增強 ? 所謂重原子取代，一般指的是鹵素 (Cl、 Br和 I)原子取代 ? 芳烴取代上鹵素原子后，其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，而磷光通常相應(yīng)地增強，這種效應(yīng)稱為“重原子效應(yīng)”。因此， π→π* 躍遷發(fā)射熒光的強度大 ? 在 π→π* 躍遷過程中，通過系間跨躍從單重態(tài)躍遷至三重態(tài)的速率常數(shù) KISC也有利于熒光的發(fā)射 2022/4/14 （ 2） 共軛效應(yīng) ? 實驗證明 ， 容易實現(xiàn) π→π* 激發(fā)的芳香族化合物容易產(chǎn)生熒光 ? 增加體系的共軛度 ， 電子的離域性越大 ， 越容易被激發(fā) ， 熒光也就越容易發(fā)生 ， 且熒光光譜向長波移動 ， 熒光效率一般也將增大 ? 共軛效應(yīng)使熒光增強的原因 ， 主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù) ， 有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子 ， 從而有利于熒光的發(fā)生 2022/4/14 幾種線狀多環(huán)芳烴的熒光 2022/4/14 ? 同一共軛環(huán)數(shù)的芳族化合物，線性環(huán)結(jié)構(gòu)者的熒光波長比非線性者要長，如蒽和菲，其共軛環(huán)數(shù)相同，前者為線性環(huán)結(jié)構(gòu)，后者為“角”形結(jié)構(gòu)，前者 λem為400nm， 后者 λem為 350nm 2022/4/14 （ 3） 剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng) ? 一般說來 ， 熒光物質(zhì)的剛性和共平面性增加 ，可以減少分子的振動 ， 使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減小 ， 即使外轉(zhuǎn)移能量損失減小 ， 從而有利于熒光的發(fā)射 ? 而且剛性平面結(jié)構(gòu)可以增大分子的吸光截面 ，增大摩爾吸光系數(shù) ， 增強熒光強度 2022/4/14 N NN N不產(chǎn)生熒光 產(chǎn)生熒光 CC O O O OCOC O O O O產(chǎn)生熒光 不產(chǎn)生熒光 ?F= C H 2 O HC H 3H 3 C萘 VA ?F(萘 )= 5?F(VA) 熒光黃 酚酞 偶氮菲 偶氮苯 2022/4/14 ? 在 ，熒光素熒光效率達 ，而酚酞卻沒有熒光 ? 芴與聯(lián)二苯，由于芴中的亞甲基使分子的剛性平面增加，導(dǎo)致兩者在熒光性質(zhì)上的顯著差別，前者熒光產(chǎn)率接近于 1，后者僅為 ? 萘與維生素 A都具有 5個共軛 π鍵，而前者為平面結(jié)構(gòu)，后者為非剛性結(jié)構(gòu)，因而前者的熒光強度為后者的 5倍 2022/4/14 （ 4） 取代基效應(yīng) ? 芳香化合物具有不同取代基時 ， 其熒光強度和熒光光譜都有很大的不同 ? 給電子基團增強熒光 ， 吸電子基團減弱熒光 ? 鹵素取代基隨原子序數(shù)增加而熒光下降 ? 取代基的空間障礙對熒光也有影響 ? 立體異構(gòu)現(xiàn)象對熒光強度有顯著的影響 ? 熒光物質(zhì)分子發(fā)生電離之后 ， 其熒光性質(zhì)也隨之發(fā)生變化 2022/4/14 ★ 給電子取代基使熒光加強 ? － NH2，－ NHR，－ NR2，－ OH，－ OR，－CN ? 基團上的 n電子云幾乎與芳環(huán)上的 π電子軌道平行，共享了共軛 π電子，形成 p～ π共軛，擴大了共軛體系。 固定激發(fā)波長為最大激發(fā)波長處 ， 以熒光或 磷光 強度 ~發(fā)射波長作圖 熒光發(fā)射光譜顯示了若干普遍的特性 ? Stokes位移 在溶液中 ， 分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長波長 ， 稱為 Stokes位移 ? 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) ? 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系 2022/4/14 熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的特征 ★ 斯托克斯位移 ? 在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)波長， λemλex ? Stokes于 1852年首次發(fā)現(xiàn)這種波長位移現(xiàn)象，故稱 Stokes位移 2022/4/14 ? 斯托克斯位移說明在激發(fā)與發(fā)射之間存在著一定的能量損失 ? 激發(fā)態(tài)分子由于振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移的無輻射躍遷而迅速衰變到 S1電子態(tài)的最低振動能級，這是產(chǎn)生其位移的主要原因 ? 其次，熒光發(fā)射時，激發(fā)態(tài)的分子衰變到基態(tài)的各振動能級，此時，不同振動能級發(fā)生振動弛豫至最低振動能級，也造成能量的損失 ? 第三，溶劑效應(yīng)和激發(fā)態(tài)分子可能發(fā)生的某些反應(yīng)，也會加大斯托克斯位移 2022/4/14 ★ 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 由于熒光發(fā)射是激發(fā)態(tài)的分子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級躍遷回基態(tài)的各振動能級所產(chǎn)生的，所以不管激發(fā)光的能量多大，能把電子激發(fā)到何種激發(fā)態(tài)，都將經(jīng)過迅速的振動弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)移躍遷至第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，然后發(fā)射熒光。 但是 ， 由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級 ， 有可能以 系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài) ， 再經(jīng)過 振動弛豫 ，轉(zhuǎn)至其最低振動能級 ， 由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時 ， 便發(fā)射磷光 2022/4/14 ? 磷光發(fā)射的躍遷仍然是自旋禁阻的，所以發(fā)光速度很慢，磷光的壽命為 10－ 4～100S ? 外光源照射停止后，磷光仍可持續(xù)一短時間 2022/4/14 外轉(zhuǎn)移 (External conversion, EC) ? 指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移 ， 使熒光或磷光強度減弱甚至消失 。2022/4/14 分子發(fā)光 — 熒光、磷光和化學發(fā)光法 2022/4/14 分子發(fā)光包括： ? 分子熒光 （ Fluorescence） ? 分子磷光 （ Phosphorescence） ? 化學發(fā)光 （ Chemiluminescence） ? 散射光譜（ Scattering Spectrum） 2022/4/14 熒光及磷光光譜法 一 、 原理 ? 第一次記錄熒光現(xiàn)象的是 16世紀西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學家 ， 他于 1575年提到 ， 在含有一種稱為 “ Lignum Nephriticum”的木頭切片的水溶液中 ， 呈現(xiàn)出極為可愛的天藍色 ? 以后逐步有一些學者也觀察和描述過熒光現(xiàn)象 ，但對其本質(zhì)及含義的認識都沒有明顯的進展 2022/4/14 ? 直到 1852年，對熒光分析法具有開拓性工作的Stokes在考察奎寧和綠色素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍為長些，而不是由光的漫反射引起的，從而導(dǎo)入熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出了“ 熒光 ”這一術(shù)語，他還研究了熒光強度與熒光物質(zhì)濃度之間的關(guān)系，并描述了在高濃度或某些外來物質(zhì)存在時的熒光猝滅現(xiàn)象 ? 第一個提出應(yīng)用熒光作為分析手段的人 2022/4/14 ? 1867年， Goppelsrode應(yīng)用鋁－桑色素配位化合物的熒光測定鋁，這是歷史上首次進行的熒光分析工作 ? 19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到 1928年，才由 Jette和 West提出了第一臺熒光計 ? 進入二十世紀以來，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，在理論或?qū)嶒灱夹g(shù)上都得到極大的發(fā)展。特別是近幾十年來，在其他學科迅速發(fā)展的影響下，隨著激光、計算機和電子學的新成就等一些新的科學及技術(shù)的引入，大大推動了熒光分析法在理論上及實驗技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的理論和新的方法 2022/4/14 ? 磷光也是某些物質(zhì)由紫外光照射發(fā)出的光，早期并沒有與熒光明確的區(qū)分 ? 1944年， Lewis和 Kasha提出了磷光與熒光的不同概念，指出磷光是分子從亞穩(wěn)的激發(fā)三重態(tài)躍遷回基態(tài)所發(fā)射出的光，它有別于從激發(fā)單重態(tài)躍遷回基態(tài)所發(fā)射的熒光 ? 磷光分析法由于其有某些特點，幾十年來的理論研究及應(yīng)用也不斷得到發(fā)展 2022/4/14 分子發(fā)光的類型 按激發(fā)的模式分類： 按分子激發(fā)態(tài)的類型分類： 光致發(fā)光 化學發(fā)光 /生物發(fā)光 熱致發(fā)光 場致發(fā)光 摩擦發(fā)光 分子發(fā)光 分子發(fā)光 熒光 磷光 瞬時熒光 遲滯熒光 按光子能量分類： 斯托克斯熒光 (Stokes)： λex λem 反斯托克斯熒光 (Antistokes)： λex λem 共振熒光 (Resonance)： λex = λem 熒光