【正文】 關(guān)系和機(jī)理：確定中國(guó)京滬城鄉(xiāng)居民血液中 B族維生素、 25羥基維生素 D（ 25(OH)D）和鈣、鎂、鐵、鋅、硒、鉻等微量元素的分布特征，以及與慢性炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗和 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；了解膳食結(jié)構(gòu)和生活方式、遺傳變異對(duì)維生素 D、 B族維生素、多種微量元素水平的影響和相關(guān)機(jī)理；并以代謝紊亂為表型的基因敲除小鼠為模型 ，探討鐵失衡與糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制。 經(jīng)費(fèi)比例： % 承擔(dān)單位：上海交通大學(xué)、中日友好醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)、北京大學(xué)人民醫(yī)院 課題負(fù)責(zé)人：賈偉平 學(xué)術(shù)骨干：項(xiàng)坤三、肖建中、樊嘉、周儉、劉赟、張健、紀(jì)立農(nóng) 課題 2：營(yíng)養(yǎng)因素與 2型糖尿病的關(guān)系及作用機(jī)制 預(yù)期目標(biāo)： 發(fā)現(xiàn)與 2型糖尿病相關(guān)的主要膳食和遺傳因素及其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制和潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，為建立適合中國(guó)漢族人群遺傳背景和膳食特 點(diǎn)的 2型糖尿病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并通過(guò)擴(kuò)大樣本驗(yàn)證前期結(jié)果，分析甲基化差異與基因表達(dá)水平的關(guān)系。另一方面，將利用已收集的人體高葡萄糖鉗夾和高胰島素－正葡萄糖鉗夾的精確數(shù)據(jù)，分析 2型糖尿病易感基因與糖尿病病理生理功能的關(guān)系。 3. 2型糖尿病易感位點(diǎn)、關(guān)鍵因子的功能研究：以 1)、 2)研究?jī)?nèi)容中新發(fā)現(xiàn)的基因變異為對(duì)象開(kāi)展功能研究。 2. 細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵因子與 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的遺傳易感性研究：以最新報(bào)告以及本項(xiàng)目其他課題組新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞應(yīng)激關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子為研究對(duì)象 ，在橫斷面病例 對(duì)照人群、前瞻人群以及家系樣本中分析基因變異與糖尿病發(fā)生、發(fā)展（糖尿病并發(fā)癥）的關(guān)系。 主要研究?jī)?nèi)容： 1. 基于全外顯子組范圍深度測(cè)序的 2型糖尿病易感性關(guān)聯(lián)研究：利用前期獲 得的中國(guó)人 2型糖尿病全外顯子組范圍（外顯子）深度測(cè)序信息，就發(fā)現(xiàn)的與 2型糖尿病易感性潛在相關(guān)的變異位點(diǎn)開(kāi)展大樣本關(guān)聯(lián)研究。 5. 開(kāi)展多層次、全方位綜合研究，以細(xì)胞、基因敲除小鼠、疾病動(dòng)物模型、靈長(zhǎng)類大動(dòng)物為研究對(duì)象，揭示 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子機(jī)制；同時(shí) 在取得醫(yī)學(xué)倫理和知情同意的情況下在人體樣本（組織、血液、尿液等）中進(jìn)一步驗(yàn)證，使臨床問(wèn)題能得到解決和回答。 4. 將 “組 ”學(xué)研究與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)相結(jié)合，應(yīng)用全外顯子組深度測(cè)序、功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，從整體和宏觀角度闡明 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。 2. 以細(xì)胞應(yīng)激為研究分子機(jī)理的中心環(huán)節(jié)，研究重要組織器官損傷的分子機(jī)理，有望發(fā)現(xiàn) 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要分子機(jī)制。 4) 建立了小鼠高葡萄糖鉗夾試驗(yàn)、小鼠高胰島素 正葡 萄糖鉗夾試驗(yàn) 等技術(shù)平臺(tái) 。 2) 已經(jīng)構(gòu)建和獲得了 lipocalin2/、 adiponectin/、 FGF21/、 HFE/、 HJV/、Smad4/、 Steap3/、 UCP1/、 UCP2/、 UCP3/等基因敲除小鼠模型。 3. 實(shí)驗(yàn)材料與技術(shù)平臺(tái)： 1) 本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)已擁有高水平的基因組、功能基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組、生物信息學(xué)等技術(shù)平臺(tái)，可保證項(xiàng)目順利實(shí)施。 6) 2 型糖尿病心血管病變 研究方面：南方醫(yī)科大學(xué)和同濟(jì)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在心血管發(fā)育、心肌細(xì)胞分化和再生治療、心臟電生理失常的致病基因克隆、 GLP1 結(jié)構(gòu)、功能和臨床應(yīng)用以及相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)的研究等方面具有原創(chuàng)性工作基礎(chǔ)。還開(kāi)展了腎臟疾病早期預(yù)警的生物學(xué)標(biāo)記的系列研究。該團(tuán)隊(duì)還獲得了運(yùn)用脂肪細(xì)胞因子作為肥胖引起的代謝疾病和心血管疾病的早期診斷和治療靶點(diǎn)的三項(xiàng)國(guó)際專利。 4) 肝臟及脂肪因子與 2型糖尿病、胰島素抵抗的研究方面：中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列新脂肪細(xì)胞因子和肝臟細(xì)胞因子：該團(tuán)隊(duì)報(bào)道了 adiponectin 具有防止脂肪肝的作用；開(kāi)發(fā)了針對(duì)人的介導(dǎo)脂代謝紊亂的因子 AFABP的高度特異性檢測(cè)試劑盒；發(fā)現(xiàn) lipocalin2是介導(dǎo)肥胖相關(guān)的炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的重要分子，并開(kāi)發(fā)了第一個(gè)用于 lipocalin2檢測(cè)的基于單克隆抗體 的快速免疫檢測(cè)方法；發(fā)現(xiàn) Angptl4 在維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)上具有重要的作用；發(fā)現(xiàn)新肝臟細(xì)胞因子 MUP1 具有增加胰島素敏感性、促進(jìn)能量代謝等作用。在 β 細(xì)胞凋亡機(jī)制研究上，已在 Diabetologia 等學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文多篇。曾多次被包括 Nature Review Geics、 Cell、 JAMA、 New Engl J Med 等權(quán)威學(xué)術(shù)雜志論文引用。 2) 營(yíng)養(yǎng)因素與 2型糖尿病的研究方面：中科院上海生科院營(yíng)養(yǎng)所進(jìn)行了肥胖、代謝綜合征、 2型糖尿病等慢性代謝性疾病的營(yíng)養(yǎng)、遺傳及危險(xiǎn)因子分析。相關(guān)文章發(fā)表在 Diabetes、 Diabetologia 等糖尿病研究領(lǐng)域重要雜志上。 2. 在前期 “973”項(xiàng)目資助下，已取得以下研究成果： 1) 在 2型糖尿病流行病學(xué)和易感基因研究方面：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院完成了大范圍社區(qū)和住院患者糖尿病及其并發(fā)癥研究，并在此基礎(chǔ)上完成所有國(guó)際上已報(bào)告的 2型糖尿病易感基因研究工作，最近還發(fā)現(xiàn) 1 個(gè)與中國(guó)人 2 型糖尿病易感性相關(guān)的新基因。這些詳細(xì)數(shù)據(jù)不僅可保證定性與定量分析需要，而且可以用于分析 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中遺傳因素與生活方式 、營(yíng)養(yǎng)元素之間在是否有交互作用。部分人群具有胰島素抵抗和胰島素分泌金標(biāo)準(zhǔn)診斷資料（葡萄糖鉗夾）、局部體脂分布精確診斷資料（磁共振檢測(cè)腹部體脂分布）。此外，糖尿病組來(lái)自住院患者，有詳細(xì)用藥情況（降糖、降脂、降壓等用藥詳細(xì)情況）、并發(fā)癥情況（大血管病變、微血管病變 ）、臨床結(jié)局（發(fā)生心血管事件、腎功能衰竭等）等指標(biāo)。上述前瞻研究資料為研究和驗(yàn)證早期診斷與干預(yù)的 標(biāo)志物提供重要支持。 2) 大樣本前瞻隨訪隊(duì)列：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院、上海市糖尿病研究所在上海曹楊、華陽(yáng)已建立 5年隨訪隊(duì)列（ N＝～ 3,000）。中科院上海生科院營(yíng)養(yǎng)所 2022 年完成了 “中國(guó)老齡人口營(yíng)養(yǎng)健康狀況研究 ”基線研究現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查（ N＝～ 3,300），樣本人群選自北京和上海的城鄉(xiāng)，以此作為中國(guó)南北地區(qū)的代表。中日友好醫(yī)院牽頭完成了 2022 年全國(guó)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查。已擁有最大的中國(guó)糖尿病家系庫(kù)（ N＝～ 7,000）、 2 型糖尿病患者庫(kù)（ N＝～ 5,000）、社區(qū)人群庫(kù)（ N＝～ 10,000）。通過(guò)分析 PERK、 CHOP、ATF BiP等指標(biāo)了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度。 在圍繞細(xì)胞應(yīng)激開(kāi)展糖尿病及主要并發(fā)癥的分子機(jī)制研究的同時(shí)，將注意重要指標(biāo)的量化和標(biāo)準(zhǔn)化。采用 RNA 干擾和小分子抑制劑判斷 GLP1發(fā)揮作用的信號(hào)途徑。采用質(zhì)譜分析法，比較這些人群呼吸氣體中代謝相關(guān)有機(jī)成分的差 異，重點(diǎn)觀察異戊二烯膽固醇，丙酮和甲基硝酸（ methyl nitrate）等在各組中的差異；采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較分析其尿液標(biāo)本組別間蛋白質(zhì)譜的差異。采用質(zhì)譜分析方法，檢測(cè)這些細(xì)胞的外吐小體中的蛋白質(zhì)水平在病變前后的變化。 6. 氧化應(yīng)激導(dǎo)致 2型糖尿病大血管損傷的作用機(jī)制 1) 分別以實(shí)驗(yàn)分離的正常大鼠和糖尿病模型大鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞為對(duì)象，觀察它們?cè)诮?jīng)由模擬糖尿病早期的慢性高血糖和高胰島素刺激后所發(fā)生的增殖、遷移和凋亡等形態(tài)學(xué)改變； 測(cè)定細(xì)胞中主要 ROS濃度，檢測(cè)線粒體功能和代謝變化；采用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過(guò)氣相色譜一質(zhì)譜 (GC/MS)對(duì)相關(guān)細(xì)胞開(kāi)展代謝組學(xué)分析。觀察氧化損傷白蛋白對(duì)血管細(xì)胞 RAS各關(guān)鍵成分（ ACE、 AⅡ 、 AT AT2）表達(dá)的影響。研究循環(huán)單核細(xì)胞或體外誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞在氧化損傷白蛋白作用下，促炎癥因子（ ELISA法）生成、吞噬 LDL（同位素標(biāo)記法）、泡沫樣變的程度和速率的變化。采用 動(dòng) 脈粥樣硬化動(dòng)物模型觀察氧化損傷白蛋白慢性負(fù)荷對(duì)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及血管活性物質(zhì)合成的作用，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，動(dòng)脈組織勻漿組織因子活性和表達(dá)，以及 PAI1 和抗凝血因子（如 Thrombomodulin）的表達(dá)。同時(shí)使用 TUDCA平行干預(yù)足細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋 亡率、標(biāo)記蛋白、 EMT標(biāo)記物等指標(biāo)的變化。并使用 TUDCA主動(dòng)干預(yù)足細(xì)胞 EMT，觀察糖尿病腎病小鼠腎組織病理、尿蛋白、足細(xì)胞凋亡率、足細(xì)胞標(biāo)記蛋白 Nephrin， WT1等、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo) GRP7 GRP94 等、線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)谷胱甘肽 (GSH)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、錳 超氧化物 歧化酶 (MnSOD)和丙二醛 (MDA)等，線粒體呼吸鏈復(fù)合物 I、 II，一氧化氮合成酶 (NOS) ，細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白 LC3 等、 EMT標(biāo)記物等的變化。觀察抑制 UCP2 蛋白的足細(xì)胞，在高糖作用下該細(xì)胞特定的重要結(jié)構(gòu)蛋白，如 Nephrin， WT1等表達(dá)與分布的變化；同時(shí)，觀察纖 維連接蛋白和整合素聯(lián)接激酶 (ILK)表達(dá)與分布的變化，分析 UCP2 對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響，以及拮抗高糖作用的可能機(jī)制。利用已構(gòu)建的 UCP2 基因缺失小鼠與配對(duì)的野生型小鼠建立 STZ糖尿病動(dòng)物模型，觀察其足細(xì)胞數(shù)目和足突的變化，以及尿白蛋白和腎功能的變化，同時(shí)比較 2 種小鼠的差異，分析 UCP2 基因缺失對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響。同時(shí)，在前述的基因敲除小鼠模型中評(píng)估這些化學(xué)先導(dǎo)物的特異性，探討藥物誘導(dǎo) adiponectin合成或通過(guò)化學(xué)或遺傳學(xué)手段抑制 AFABP對(duì)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的影響，探討其在治療肥胖相關(guān)代謝性疾病 中 的可能性。根據(jù) AFABP 的蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成可特異性抑制 AFABP 活性的新型小分子化合物。 5) 中樞神經(jīng)系統(tǒng)在肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島素抵抗發(fā)生過(guò)程中的作用：利用 Flox條件刪除系統(tǒng)，在小鼠中樞特定腦區(qū)或神經(jīng)元?jiǎng)h除目的基因（ CPT1A, APPL2， AMPK r GPR11 Ahi等），之后檢測(cè)肝臟胰島素信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活狀態(tài)及對(duì)應(yīng)特定腦區(qū)的生理變化，闡述目的基因在中樞中對(duì)肝臟功能的調(diào)控作用。并 在 前瞻人群中做進(jìn)一步的預(yù)測(cè)驗(yàn)證，最終評(píng)估這些脂肪細(xì)胞因子 /肝臟細(xì)胞因子是否適用于監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展進(jìn)程，將這些疾病的預(yù)防及治療時(shí)間推前。通過(guò)葡萄糖耐 量 實(shí)驗(yàn)和胰島素耐 量 實(shí)驗(yàn)研究 FGF21或 adropin缺失對(duì)各個(gè)主要代謝組織（脂肪組織、肝臟、肌肉）胰島素敏感性的影響。在細(xì)胞水平上，我們將從小鼠分離原代肝細(xì)胞，研究重組 lipocalin2， AFABP 或 /和 adiponectin蛋白對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的直接影響，并研究其信號(hào)通路。檢測(cè) AFABP和lipocalin2轉(zhuǎn) 基因兔和野生型兔及小鼠模型在脂質(zhì)代謝及肝臟脂肪沉積過(guò)程方面的差異。分析肝臟脂肪和肝臟胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)；采用 NFκB、 ATF IREPREK、 peLF XBP1特異剪切形式 、 GRP7 JNK等蛋白表達(dá)的定量及活性檢測(cè)分析肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)； 研究 AFABP和 /或lipocalin2在體內(nèi)過(guò)表達(dá)與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪肝和肝臟胰島素抵抗的關(guān)系， adiponectin過(guò)表達(dá)是否可防止上述病變的發(fā)生。同時(shí)還可以通過(guò)給予降尿酸藥物別嘌呤醇等，觀察在高尿酸血癥的條件下其對(duì)胰島細(xì)胞直 接或間接的保護(hù)作用。 9) 尿酸誘導(dǎo)胰島 β細(xì)胞損傷：設(shè)計(jì)大樣本人群研究，通過(guò)觀察糖代謝、胰 島素分泌及胰島素敏感性等指標(biāo)，進(jìn)一步闡明體內(nèi)高尿酸與細(xì)胞損傷的相關(guān)關(guān)系；利用小鼠原代分離胰島和 β細(xì)胞系 MIN6 觀察不同濃度和處理時(shí)間條件下，尿酸對(duì) β細(xì)胞生存周期、凋亡以及 GSIS的影響。 7) 篩選藥物靶點(diǎn)：針對(duì)上述功能明確的基因，運(yùn)用藥物篩選系統(tǒng)尋找選擇合適的激動(dòng)劑或抑制劑，初步探討這些基因作為 2型糖尿病防治靶點(diǎn)的可能性。 5) 借助于過(guò)表達(dá)和 RNA 干擾的方法，了解候選基因?qū)σ葝u β 細(xì)胞功能和數(shù)量的影響：構(gòu)建候選基因的過(guò)表達(dá)和干擾腺病毒載體，感染 MIN6 細(xì)胞，觀察這些基因表 達(dá)的增加或缺失對(duì) MIN6 細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌功能以及對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響；過(guò)表達(dá)或者 RNA 干擾候選基因表達(dá)后，加入脂肪酸處理一段時(shí)間，從胰島 β細(xì)胞功能以及細(xì)胞活力兩方面評(píng)估候選基因的功能，希望找到數(shù)個(gè)在脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性胰島 β細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用的基因。 3) 構(gòu)建啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因是否受 FoxO1調(diào)控，以及受調(diào)控的程度和方式：將挑選基因啟動(dòng)子克隆至 pGL3basic 質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞，經(jīng)脂肪酸處理，分析這 些基因的啟動(dòng)子的活性變化；干擾 FoxO1表達(dá)，觀察這些啟動(dòng)子在脂肪酸處理后的活性變化是否被逆轉(zhuǎn)；將 FoxO1的持續(xù)失活突變體（ DNFoxO1）或者持續(xù)激活突變體（ ADAFoxO1）與啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 MIN6細(xì)胞，確定 FoxO1對(duì)這些基因的調(diào)控程度； 4) 采用 定量 RTPCR及 Western Blot的方法，進(jìn)一步明確哪些基因被 FoxO1調(diào)控：在小鼠胰島 β細(xì)胞系 Min6細(xì)胞中加入脂肪酸處理，明確候選基因 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化；通過(guò)干擾 FoxO1表達(dá)和過(guò)表達(dá) DNFoxO1和ADAFoxO1， 分析候選基因在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控的情況；分離 2型糖尿病模型小鼠（ ob/ob或 db/db小鼠）的原代胰島，比較糖尿病模型小鼠與其同背景對(duì)照鼠之間這些基因的表達(dá)差異，在體驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肥胖模型小鼠內(nèi) FoxO1靶基因的變化。 3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致胰島 β細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究： 1) 制備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型，選擇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)