【正文】 可使體系增敏 ，已用于測(cè)定甲胎蛋白 ， 靈敏度放大兩個(gè)數(shù)量級(jí) 。 微粒上又結(jié)合著標(biāo)記酶 ，其數(shù)量遠(yuǎn)比第二抗體能結(jié)合的標(biāo)記酶多 ， 因此得以放大 。 ? 每個(gè)微粒表面可以同時(shí)結(jié)合大量記酶和抗體分子 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 ② 微粒放大 。 ? 每個(gè)親和素分子能結(jié)合 4個(gè)生物素 ， 因而可 偶聯(lián)更多的聯(lián)結(jié)生物素的酶分子 ， 從而提高 ELISA的敏感性 。 ? 生物素與親和素結(jié)合速率較快且結(jié)合物的穩(wěn)定性高 （K=1015） ， 不會(huì)在孵育和各種洗滌過(guò)程中脫落 。 ? 采用放大系統(tǒng) 是提高 ELISA靈敏度的 主要途徑 。 ? 改用熒光標(biāo)記 或其他化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記抗體替代酶標(biāo)記抗體可以提高靈敏度 。 ）結(jié)合物溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）結(jié)合物中酶量（ mLmLmgmg ?? /%1 0 0% ?? ）標(biāo)志時(shí)加入的酶量（ ）結(jié)合物中酶量（酶結(jié)合率 mgmgH R P H R P / H R P H R P / 1 6 0 0 0 0I g G I g G / I g G I g G / 4 0 0 0 0m g m L m g m Lm g m L m g m L? ? ? ?（ ） 分 子 量 （ ）（ 摩 爾 比 ）（ ） 分 子 量 （ ）第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 ELISA的靈敏度與 ELISA放大系統(tǒng) （ 1） ELISA的靈敏度 ELISA的檢出限已經(jīng)達(dá)到 108～1012g， 但對(duì)某些測(cè)定仍需更高的靈敏度 。 ? 其中 ， A403nm值為 1時(shí) ， 酶量為 ； A403nm值為 1時(shí) ， 其相應(yīng) A280nm值為 ； A280nm值為 1時(shí) ， IgG量為 ； 表示酶 、 戊二醛結(jié)合后 ， A280nm增加約 6％ 。 ? 酶 底物反應(yīng)時(shí)間一般采用 15min、 30min或 45min， 也可以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為準(zhǔn) ， 隨時(shí)測(cè)定其 OD值 ， 當(dāng) 達(dá)到規(guī)定的 OD值時(shí) ， 即終止反應(yīng) 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 酶 底物反應(yīng)時(shí)間的選擇 ? 抗原與抗體 、 抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在 37℃ 反應(yīng) 2～ 3h達(dá)到高峰 。 177。 SD）（ n=4） 4 177。 ? 此濃度稱為 抗原的飽和包被濃度 。 ? 選擇 吸光度為 1的稀釋度 作為酶標(biāo)抗體最適濃度 。 ? 因?yàn)橹苽淇姑缚贵w必須在動(dòng)物中進(jìn)行 ， 故抗酶抗體法多 適用于檢測(cè)動(dòng)物中的抗體 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 ? 優(yōu)點(diǎn) :HRP通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)與抗體結(jié)合 ， 避免了用化學(xué)方法交聯(lián)時(shí)抗體活性的改變 ， 也避免了 HRP與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合 ， 防止 標(biāo)記抗體和游離的未標(biāo)記抗體之間的 競(jìng)爭(zhēng) ， 提高了標(biāo)記抗體的質(zhì)量 。 ? 讓這種抗 IgG的 第二抗體 把 第一抗體 （ 兔 IgG） 和 抗酶抗體 （ 也為兔 IgG） 通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)連接起來(lái) 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 圖 78 異種動(dòng)物抗體夾心法 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 5） 抗酶抗體法 ? 抗酶抗體法 （ 圖 79） 是 利用免疫學(xué)反應(yīng) 而不是用化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)來(lái) 制備酶結(jié)合物 ， 常用 HRP為標(biāo)記酶 作為抗原 免疫動(dòng)物制備抗 HRP抗體 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 圖 77 競(jìng)爭(zhēng)法 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 4） 異種動(dòng)物抗體雙夾心法 ? 異種動(dòng)物抗體雙夾心法 （ 圖 78） ， 又稱 間接雙抗體夾心法 （ indirect DASELISA） 或 三抗體夾心法 （triple antibodies sandwich， TASELISA） 。 ? 該方法不必為每個(gè)待測(cè)抗體 （ 或抗原 ） 制備特異性的酶標(biāo)抗抗體 （ 或酶標(biāo)抗體 ） ， 極大地 簡(jiǎn)化 了實(shí)驗(yàn) 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 圖 75 雙抗體夾心法 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 2） 間接法 ? 間接法 （ indirect ELISA） 是最常用的 ELISA檢測(cè)方法 ， 其原理是利用 酶標(biāo)記的抗體 和已與 固相抗原 結(jié)合的受檢 抗體 相結(jié)合 。 ? 該法的 靈敏度高 ， 特異性強(qiáng) ，但提純免疫球蛋白和制備酶標(biāo)記物要求 技術(shù)性強(qiáng) ， 成本較高 。 ? 如 雙抗體夾心法 、 間接法 、 競(jìng)爭(zhēng)法 、 異種動(dòng)物抗體雙夾心法 、 抗酶抗體法 、 競(jìng)爭(zhēng)性抑制法 、 雙夾心法 和 抗原直接包被法 等方法。 ? 圖 74 過(guò)碘酸鹽氧化法 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 ELISA試驗(yàn)方法 ? ELISA法中有三個(gè)必要試劑： ① 固相抗原 或抗體； ②酶標(biāo)記抗原 或抗體； ③ 酶反應(yīng)底物 。 ? 辣根過(guò)氧化物酶 （ HRP） 的標(biāo)記常用此法 。 ? 兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以 1:1的比例結(jié)合的 ， 有助于本底的改善 。 ? 缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是 隨機(jī)的 ， 酶與酶 、 抗體與抗體之間有可能交聯(lián) 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 抗 體 N H2+ HC CHO ON H2 酶+抗 體C CNH HN 酶抗 體C CNH HN 抗 體酶C CNH HN 酶++圖 72 戊二醛一步法反應(yīng)原理 ① 一步法 將戊二醛 直接加入 酶與抗體的混合物中 ， 反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體 。 ? （ 1） 戊二醛交聯(lián)法 戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以 聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì) 。 （ 4） 青霉素酶 （ PNC） 的底物系統(tǒng) 常用底物有 溴麝香草酚藍(lán) （ BTB） 、 青霉酮酸還原淀粉 碘復(fù)合物 （ SIC） 、 溴甲酚紫 （ BCP） 和 溴麝香草酚藍(lán) （ 2︰ 1） 等 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 3） β D半乳糖苷酶 的底物系統(tǒng) 常見(jiàn)底物有 鄰硝基苯 β D半乳糖苷 （ ONPG） ， 其水解的產(chǎn)物鄰硝基苯酚在 405nm處具有最大吸光度值 。 ? 用 酚酞磷酸酯 為底物 ， 水解生成的酚酞在堿性條件下呈紅色 ， 可在 530nm處光度法測(cè)定 。 ? TMB的 背景值低 ， 溶液 穩(wěn)定 ， 沒(méi)有誘變 特性 。 ? ABTS的 反應(yīng)曲線不好 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 ELISA法常用酶的底物系統(tǒng) ? ELISA法 對(duì)底物的要求 ： ? 價(jià)廉易得 、 安全 ； ? 顯色性 和 穩(wěn)定性 好 ； ? 底物 本身最好 為 無(wú)色 物質(zhì) ； ? 終止 酶催化反應(yīng)后 ， 底物 不應(yīng)再 繼續(xù)地 自發(fā)性變性 ； ? 其最終 產(chǎn)物可溶 、 易于測(cè)定 及 光吸收值高 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 編號(hào) 吐溫20/% 組成 稀釋液 1 PBS ， pH 2 PBS ， pH 3 PBS ， pH ，含 EDTA 10mmol/L 4 PBS ， pH ，含 EDTA 10mmol/L 洗滌液 1 PBS ， pH 2 PBS ， pH 3 TrisHCl緩沖液 ， pH ， NaCl 表 72 常用的抗體稀釋液和洗滌液 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 3） 酶反應(yīng)終止液 ? 辣根過(guò)氧化物酶 （ HRP） 反應(yīng)終止液為 2mol/L～ 4mol/L H2SO4（ HRP在酸性條件下喪失酶活性 ） 。 （ 2） 洗滌液 一般與稀釋液相同 ， 常用 PBS或 TrisHCl緩沖液 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 稀釋液 、 洗滌液和酶反應(yīng)終止液 （ 1） 稀釋液 用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本 。 ? 所有的 ELISA固相載體均需封閉 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 2） 封閉 （ blocking） 指繼包被之后用 高濃度 的 無(wú)關(guān)蛋白質(zhì) 溶液 再包被 的過(guò)程 。 ? 一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 ～ 20181。 ? 以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例 ， 通常先將抗原或抗體溶于 pH 碳酸鹽緩沖液 （ 或 pH ， pH 7～ 8的 TrisHCl緩沖液 ） 中 ， 加滿反應(yīng)孔 ， 置4℃ 過(guò)夜 ， 洗滌即可 。 ? ELISA載體的形式有 小試管 、 小珠 和 微量反應(yīng)板 。 ? 最常用的是 聚苯乙烯 。 ? *Ag是 酶標(biāo)志抗原 ， Ag是 未標(biāo)志抗原 ， Ab是特異性抗體， (F)表示游離型的 *Ag， (B)表示結(jié)合型的 *AgAb。 ? Gal比活 力 應(yīng)不少于 30U/mg， 5℃ 能保存 1～ 2年 。 ? 當(dāng) Gal催化水解 β D半乳糖苷時(shí) ， 若得到的半乳糖殘基轉(zhuǎn)移到水分子受體 ， 稱為 水解 ；若受體是糖或醇時(shí)， 稱為 轉(zhuǎn)半乳糖苷 。 ? 葡萄糖氧化酶在 4℃ 下可穩(wěn)定存在 6～ 12個(gè)月 。 葡萄糖氧化酶對(duì) β D葡萄糖的 β 異頭碳有 高度專一性 。 ? 它催化 O2和 β D葡萄糖的反應(yīng)形成 H2O2和 D葡萄糖酸δ 內(nèi)酯 ， 酯再與水反應(yīng)生成葡糖酸 。 ? 用作標(biāo)記的 AP比活 力 應(yīng) 大于 1000U/mg。 ? 堿性磷酸酶的分子質(zhì)量為 80～ 100kDa， 最適 pH為 ～ ， 隨