【正文】 光酶聯(lián)免疫分析 圖 712 吖啶酯氧化反應(yīng)過程 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑的典型代表是 光澤精 （ N,N′ 二甲基吖啶硝酸酯 ） 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 圖 714 魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結(jié)構(gòu)式 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 圖 715 魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ 3） 咪唑類化合物 咪唑類發(fā)光劑主要 是 咯吩堿 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 CLEIA常用的標(biāo)記酶 ? CLEIA方法中最常用的是辣根過氧化物酶和 葡萄糖氧化酶 （ GOD） 。 ? 常見發(fā)光反應(yīng)底物有 魯米諾 、 TCPO等 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 ? 將高靈敏度的 生物發(fā)光 與特異性的 酶聯(lián)免疫分析 技術(shù)相結(jié)合便形成生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法 （ BLEIA） 。 ? 葡萄糖 6磷酸脫氫酶的活性較好 ， 1018mol/L的葡萄糖 6磷酸脫氫酶每分鐘能產(chǎn)生 1014mol/L的NADH， 這樣可以大大提高靈敏度 ， 對 TNT的檢測限達(dá) 1018mol/L。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ 3） 以 熒光素酶為標(biāo)記酶 ， 以 熒光素酶 熒光素發(fā)光體系 的生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析測定了轉(zhuǎn)鐵蛋白 、 胰島素、 艮他霉素 、 氨甲蝶呤 、 馬來酰亞胺苯甲?；?N琥珀酰亞胺 、 孕酮 、 人絨毛膜促性腺激素 、 甲胎蛋白 、促黃體生成激素等； ? 以 熒光素酶 FMN生物發(fā)光體系 的生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析測定了二硝基苯酚 、 三硝基甲苯 、 甲胎蛋白等各種物質(zhì) 。 （ 1） 以 HRP為標(biāo)記酶 標(biāo)記抗原或抗體 ， 以 魯米諾 H2O2為底物 測定了單純皰疹病毒 、 人絨毛膜促性腺激素 、 白色念珠菌等物質(zhì)； ? 以 異魯米諾 H2O2為底物 測定了巨細(xì)胞病毒抗原 、 甲胎蛋白 、 抗魯白寧 IgG、 皮質(zhì)醇等； ? 以 鄰苯三酚 H2O2為底物 測定登革熱 Ⅱ 型病毒 b、 傷寒桿菌 、 細(xì)菌內(nèi)毒素等物質(zhì) 。 ? 利用上述 生物發(fā)光反應(yīng)與 一個 酶催化的反應(yīng)相耦合 ，即可進(jìn)行生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 。 ? 生物發(fā)光 現(xiàn)象的化學(xué)本質(zhì)就是 熒光素 與 熒光素酶 發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ， 可看成是特殊形式的化學(xué)發(fā)光 。 ? 另外一些 金屬配合物 能催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 。 ? CLEIA方法的檢測限低至 1017mol/L， 達(dá)到或超過放射免疫分析的靈敏度 。 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 （ 2） 氨基苯二酰肼類化合物 魯米諾 （ 5氨基 2,3二氫 1,4酞嗪二酮 ） 、 異魯米諾 （ 6氨基 2,3二氫 1,4酞嗪二酮 ） 及其 衍生物 如氨丁基乙基異魯米諾 （ABEI） 、 氨己基乙基異魯米諾 （ AHEI） 、 氨丁基乙基魯米諾 （ ABENH） 等 均 屬于這一類化學(xué)發(fā)光劑 。 ? 在 加入 H2O2及隨后加入 NaOH調(diào)節(jié)至所需 pH之前維持一低 pH以實現(xiàn) 最佳氧化 過程 ， 可加速其氧化反應(yīng) 。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級 回到基態(tài) 的各個振動能級時，以 光輻射 的形式釋放能量，這個發(fā)光過程稱為 化學(xué)發(fā)光 ，其反應(yīng)過程如下： ? ? 發(fā)光效率 表示一個化學(xué)發(fā)光分子的量子產(chǎn)率 ，指 每摩爾反應(yīng)物 輻射出光子的量。 （ 5） 與酶聯(lián)抗抗體反應(yīng) ：再加入 1︰ 50稀釋的 GARIgGHRP 200μ L/孔 ， 37℃ 保溫 1h。 ? 完整的 ELISA試劑盒 應(yīng)包含 包被好的固相載體 、 酶結(jié)合物 、 底物 和 各種濃縮的稀釋液 、 緩沖液 等 。 ? 每個微粒表面可以同時結(jié)合大量記酶和抗體分子 。 ? 采用放大系統(tǒng) 是提高 ELISA靈敏度的 主要途徑 。 ? 酶 底物反應(yīng)時間一般采用 15min、 30min或 45min， 也可以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為準(zhǔn) ， 隨時測定其 OD值 ， 當(dāng) 達(dá)到規(guī)定的 OD值時 ， 即終止反應(yīng) 。 ? 此濃度稱為 抗原的飽和包被濃度 。 ? 讓這種抗 IgG的 第二抗體 把 第一抗體 （ 兔 IgG） 和 抗酶抗體 （ 也為兔 IgG） 通過免疫學(xué)反應(yīng)連接起來 。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 圖 75 雙抗體夾心法 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 2） 間接法 ? 間接法 （ indirect ELISA） 是最常用的 ELISA檢測方法 ， 其原理是利用 酶標(biāo)記的抗體 和已與 固相抗原 結(jié)合的受檢 抗體 相結(jié)合 。 ? 辣根過氧化物酶 （ HRP） 的標(biāo)記常用此法 。 ? （ 1） 戊二醛交聯(lián)法 戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以 聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì) 。 ? TMB的 背景值低 ， 溶液 穩(wěn)定 ， 沒有誘變 特性 。 （ 2） 洗滌液 一般與稀釋液相同 ， 常用 PBS或 TrisHCl緩沖液 。 ? 一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 ～ 20181。 ? *Ag是 酶標(biāo)志抗原 ， Ag是 未標(biāo)志抗原 ， Ab是特異性抗體， (F)表示游離型的 *Ag， (B)表示結(jié)合型的 *AgAb。 葡萄糖氧化酶對 β D葡萄糖的 β 異頭碳有 高度專一性 。 第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 ② 堿性磷酸酶 （ alkaline phosphatase， AP） 幾乎存在于動物和人體的所有組織中 ， 尤其在肝臟 、 胎盤 、 白細(xì)胞 、 腎小管中含量高 。 ? 酶的比活 力 指在特定條件下，每 1mg酶 或 每 1ml酶液所具有的酶活性單位數(shù) 。 ? 抗原抗體分子 之間存在著結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性和親和性 ， 使得抗原與相應(yīng)抗體之間 極 易發(fā)生結(jié)合反應(yīng) ， 這種反應(yīng) 具有 高特異性 （ 即專一性 ） 和 可逆性 。 ? 免疫原性 （ immunogenicity） 指 誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力 。 第 七 章 酶聯(lián)免疫分析 法 第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 第二節(jié) 光度酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 一 、 免疫分析 免疫分析發(fā)展史 ? 免疫分析 （ Immunoassay， IA） 是利用 待測物質(zhì) （ 抗原或抗體 ） 與其 相對應(yīng)物質(zhì) （ 抗體或抗原 ） 之間 專一特異性反應(yīng) 而建立起來的一種 高選擇性 分析方法 。 ? “ 免疫 （ immunity） ” 一詞源于 “ immunitas” ， 原意是免除稅賦和差役 。 ? 具備上述兩種特性的物質(zhì)為 完全抗原 ， 僅具有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)被稱為 半抗原 （ hapten） 。 ? 抗體主要存在于血清中 ， 在抗原 、 抗體的檢測中多采用血清做試驗 ， 所以 體外抗原 抗體反應(yīng) 也稱為 血清學(xué)反應(yīng) （ serologic reaction） 。 第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 酶 來源 EC編號 辣根過氧化物酶 辣根 酸性磷酸酶 動植物 堿性磷酸酶 牛腸 βD半乳糖苷酶 大腸桿菌 葡萄糖氧化酶 曲霉菌 脲酶 Jack豆 青霉素酶 — 過氧化氫酶 肝 葡萄糖淀粉酶 根霉菌 碳酸苷酶 牛紅細(xì)胞 乙酰膽堿酶 — 葡萄糖 6磷酸脫氫酶 腸系膜明串細(xì)菌 溶菌酶 雞卵白 蘋果酸脫氫酶 豬心線粒體 無機(jī)焦磷酸酶 大腸桿菌 熒光素酶 發(fā)光生物 丙酮酸激酶 哺乳動物組織 酶聯(lián)免疫分析常用酶 第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 ① 辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase， HRP）是 一種 提取 自 辣根中 ， 相對 分子質(zhì)量為 44kDa的 糖蛋白 。 ? AP活性的測定以 對硝基磷酸苯酯 （ PNP） 作為底物 。 第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 ④ β D半乳糖苷酶 （ β Dgalactosidase， Gal） 即 乳糖酶 （ β lactase） ， 廣泛存在于植物 、 動物器官 、細(xì)菌 、 酵母和真菌中 。 ? 聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高 ， 但空白值也略高 。 ? 封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙 ， 從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附 。 ? 很多 ELISA試劑采用 堿性磷酸酶 （ AP） 作為標(biāo)記酶 ， 用3mol/L NaOH終止酶反應(yīng)后 ， 黃色可穩(wěn)定一 段 時間 。 ? 此外還可以 百里酚酞單磷酸酯 等 為 底物 。 ? 該法操作 簡便 、 有效 ，重復(fù)性好 。 ? 根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 圖 76 間接法 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法 （ 3） 競爭法 ? 競爭法 （ peting ELISA） 是利用 待測抗原 和 酶標(biāo)抗原 與 特異性抗體 競爭結(jié)合 ， 或 待測抗體和酶標(biāo)抗體與特異性抗原競