【正文】 第 七 章 酶聯免疫分析 法 第 七 章 酶聯免疫分析 法 ? 基本要求： ? 了解免疫分析發(fā)展史 ， 掌握抗原 、 抗體和免疫反應的原理 ， 了解免疫分析法的分類 ， 熟悉酶標記免疫分析法中使用的酶 ， 熟悉 ELISA的原理 ， 掌握 ELISA的固相載體 、 包被與封閉 、 稀釋液 、 洗滌液 、 酶反應終止液及 ELISA法常用酶的底物系統(tǒng) ， 掌握 ELISA的酶聯方法和試驗方法 ， 熟悉 ELISA反應條件的選擇 ， 掌握 ELISA的定量計算 ， 了解 ELISA的靈敏度提高途徑 ， 熟悉ELISA放大系統(tǒng) 。 了解化學發(fā)光分析的原理 ， 熟悉化學發(fā)光劑的種類 ， 熟悉化學發(fā)光酶聯免疫分析常用的標記酶和發(fā)光增強劑 ， 熟悉生物發(fā)光酶聯免疫分析常用的生物發(fā)光反應體系 。 第 七 章 酶聯免疫分析 法 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 第二節(jié) 光度酶聯免疫分析 第三節(jié) 發(fā)光酶聯免疫分析 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 一 、 免疫分析 免疫分析發(fā)展史 ? 免疫分析 （ Immunoassay， IA） 是利用 待測物質 （ 抗原或抗體 ） 與其 相對應物質 （ 抗體或抗原 ） 之間 專一特異性反應 而建立起來的一種 高選擇性 分析方法 。 ? 免疫分析主要基于用 抗體 （ 或抗原 ） 作為選擇性化學試劑以分析 測定抗原 （ 或抗體 ） 及 半抗原 。 ? 宋代 人工痘苗 預防烈性傳染病天花 ? 1971年 第一屆國際免疫學會議 將免疫學與微生物學分開發(fā)展成一門獨立的學科 。 ? “ 免疫 （ immunity） ” 一詞源于 “ immunitas” ， 原意是免除稅賦和差役 。 ? 研究早期免疫學多集中在 抗體抗感染能力 研究 。 ? 20世紀中期以后 ， 人們逐漸 開始 對各種抗原 、 微生物的作用進行研究 ， 發(fā)展 出 基礎免疫學 、 臨床免疫學 、免疫學檢測 、 醫(yī)學免疫學等多個分支 。 ? 現代免疫學將 “ 免疫 ” 定義為： 機體 對 “ 自己 ” 和 “異己 ” 識別 、 應答過程中所產生的 生物學效應的總和， 正常情況下是 維持內環(huán)境穩(wěn)定 的一種生理性功能 。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 抗原 、 抗體與免疫反應 ? 抗原 是能夠引起免疫反應的分子 。 ? 免疫原性 （ immunogenicity） 指 誘導刺激免疫系統(tǒng)產生抗體或致敏淋巴細胞的能力 。 ? 具有免疫原性的物質稱為 免疫原 （ immunogen） 。 ? 免疫反應原性 （ immunoreactivity） 或 抗原性 （antigenicity） ， 指能與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合 ， 引起免疫反應的性能 。 ? 具備上述兩種特性的物質為 完全抗原 ， 僅具有免疫反應性的物質被稱為 半抗原 （ hapten） 。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ? 抗體 是能與抗原發(fā)生特異性結合的 免疫球蛋白 。 ? 所有的抗體都是免疫球蛋白 ， 但并非所有的免疫球蛋白都是抗體 。 ? 例如 無免疫活性的免疫球蛋白 （ 如 骨髓瘤蛋白 ） 就不是抗體 ， 盡管 其結構與抗體相似 。 ? 抗體主要存在于血清內 ， 但在其他體液及外分泌液中也有存在 。 ? 抗原抗體分子 之間存在著結構互補性和親和性 ， 使得抗原與相應抗體之間 極 易發(fā)生結合反應 ， 這種反應 具有 高特異性 （ 即專一性 ） 和 可逆性 。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ? 抗原 、 抗體發(fā)生如下免疫反應： ? Ag+Ab AgAb ? 該免疫反應遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學基本原理 ， 其反應式為 ? 式中： [Ab]為游離的抗體結合位點的濃度； [Ag]為游離的抗原結合位點的濃度； [AbAg]為抗原 抗體復合物的濃度； k1為正反應速率常數； k2為負反應速率常數； K為 反應平衡常數 （ 親和常數 ） 。 ? ??Kkk ??21[A b][A g ]A g ][A b第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ? 這種抗原 抗體反應 既 可發(fā)生于體內 （ in vivo） ， 也可發(fā)生于體外 （ in vitro） 。 ? 抗體主要存在于血清中 ， 在抗原 、 抗體的檢測中多采用血清做試驗 ， 所以 體外抗原 抗體反應 也稱為 血清學反應 （ serologic reaction） 。 ? 基于抗原 抗體反應的檢測技術主要應用于以下幾個方面： ① 用已知抗原 檢測未知抗體 ； ② 用已知抗體 檢測未知抗原 ； ③ 定性或定量 檢測 體內 各種大分子物質 ； ④ 用已知抗體 檢測 某些藥物 、 激素等各種 半抗原 物質 。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 二、 酶標記免疫分析法及常用標記酶 免疫分析法分類 免疫分析 標記免疫分析 放射免疫分析法 化學發(fā)光免疫分析法 電化學免疫分析法 熒光免疫分析法 酶聯免疫分析法 競爭性酶聯免疫分析 非競爭性酶聯免疫分析 均相酶聯免疫分析 非均相酶聯免疫分析 非標記免疫分析 沉淀反應、凝集反應、免疫電泳、免疫擴散 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 酶標記免疫分析法中使用的酶 （ 1）酶聯免疫分析中使用的酶應 符合下列條件 ： ① 純度高 、催化反應的轉化速率高、 專一性強 ； ② 具有 足夠的 偶聯用 標記基團 ，與抗原、抗體蛋白分子偶聯后仍保持較高的催化活性； ③ 使用 穩(wěn)定性 和保存穩(wěn)定性 好 ； ④ 測定 酶活性的 方法簡便 、 靈敏 、 快速 ； ⑤ 待測 體液中不存在 與標記酶相同的酶； 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ⑥ 待測溶液中 應該 無底物 、 反應抑制劑 和其他與酶發(fā)生反應的 干擾物質 ； ⑦ 酶的來源、純化和供應 較方便 ，價格 較低廉 ； ⑧ 均相酶免疫測定 法中使用的酶，還要求當抗體與半抗原 酶 結合物結合 后，酶活性表現出 抑制或激活 。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 （ 2） 酶的評價指標 通常 用 RZ和 酶的比活 力評價 標記酶的質量。 ? RZ表示酶蛋白中 活性部分 與 非活性部分 最大吸光度的比值。 ? 酶的比活 力 指在特定條件下，每 1mg酶 或 每 1ml酶液所具有的酶活性單位數 。 （ 3） 酶聯免疫分析中的常用酶 下表 列出了酶聯免疫分析中的常用酶。 其中 EC編號 是 根據國際酶學委員會的規(guī)定采用四碼編號法確定的每個酶的系統(tǒng)編號。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 酶 來源 EC編號 辣根過氧化物酶 辣根 酸性磷酸酶 動植物 堿性磷酸酶 牛腸 βD半乳糖苷酶 大腸桿菌 葡萄糖氧化酶 曲霉菌 脲酶 Jack豆 青霉素酶 — 過氧化氫酶 肝 葡萄糖淀粉酶 根霉菌 碳酸苷酶 牛紅細胞 乙酰膽堿酶 — 葡萄糖 6磷酸脫氫酶 腸系膜明串細菌 溶菌酶 雞卵白 蘋果酸脫氫酶 豬心線粒體 無機焦磷酸酶 大腸桿菌 熒光素酶 發(fā)光生物 丙酮酸激酶 哺乳動物組織 酶聯免疫分析常用酶 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ① 辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase， HRP）是 一種 提取 自 辣根中 ， 相對 分子質量為 44kDa的 糖蛋白 。 ? 其酶學活性部分包括 脫輔基蛋白 和 血紅素基團 ， 輔基亞鐵血紅素在 403nm波長呈現最大光吸收值 。 ? HRP的純度以 RZ值即 A403nm/A275nm的值來衡量 ， 高純度HRP制劑的 RZ≥ 。 ? 通常以能在 20℃ 、 pH為 、 20s的時間內催化底物 鄰苯三酚 產生 1mg紅桔酚 （ purpurogallin） 作為 HRP酶的 1個活性單位 。 ? 用于標記的 HRP比活性應 大于 250U/mg。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ② 堿性磷酸酶 （ alkaline phosphatase， AP） 幾乎存在于動物和人體的所有組織中 ， 尤其在肝臟 、 胎盤 、 白細胞 、 腎小管中含量高 。 ? AP是一種 磷酸酯 的水解酶 ， 它能夠催化磷酸單酯 、 磷酸核苷 及 6磷酸糖類 等的水解 ， 在釋放磷酸鹽的同時產生有色的或熒光的產物 。 ? 堿性磷酸酶的分子質量為 80～ 100kDa， 最適 pH為 ～ ， 隨酶源和底物的不同而變化 。 ? AP活性的測定以 對硝基磷酸苯酯 （ PNP） 作為底物 。 ? 用作標記的 AP比活 力 應 大于 1000U/mg。 第一節(jié) 酶聯免疫分析概述 ③ 葡萄糖氧化酶 （ glucose oxidase， GOD） 即 β D葡萄糖氧化還原酶 ， 一般由黑曲霉和青霉產生 。 ? 它催化 O2和 β D葡萄糖的反應形成 H2O2和 D葡萄糖酸δ 內酯 ， 酯再與水反應生成葡糖酸 。 ? 其反應最適 pH范圍為 ～ ， ， 反應速率最大 。 葡萄糖氧化酶對 β D葡萄糖的 β 異頭碳有 高度專一性 。 ? 葡萄糖