【正文】 胞 神經(jīng)元相互作用的調(diào)節(jié)及其在 DA 能神經(jīng)元損傷中的作用；進(jìn)一步證實(shí) PHOX/MMP9 在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥和氧化應(yīng)激以及 DA 能神經(jīng)元損傷中的作用，為其作為神經(jīng)保護(hù)作用靶點(diǎn)提供依據(jù)；深入闡明 p75Trk、p75sortilin 分子間相互作用的功能結(jié)構(gòu)區(qū)、及其藥物干預(yù)與生物效應(yīng)的新靶位意義 ； 明確誘導(dǎo)活化的膠質(zhì)細(xì)胞反作用于神經(jīng)元對(duì)PINK1 和 α Syn 基因基因異常表達(dá)的影響及自噬、凋亡的發(fā)生 。 3. 研究 MPP+/LPS 對(duì) 各種混合 培養(yǎng)體系中 DA 能神經(jīng)元損傷的影響及其機(jī)制；長時(shí)程實(shí)時(shí)觀察經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用；體外建立PHOX/MMP9 基因敲除鼠黑質(zhì)神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察MPP+/6OHDA/LPS 對(duì)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響 ， 分析相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；應(yīng)用生物信息學(xué)、蛋白功能域分析鑒定和單克隆抗體封閉等技術(shù)，1. 對(duì)社區(qū)人群中存在危險(xiǎn)遺傳基因和環(huán)境暴露個(gè)體進(jìn)行檢查和確診；發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)劑保護(hù) DA 神經(jīng)元的潛在靶點(diǎn)。 第 五 年 1. 繼續(xù)篩選、隨訪追蹤社區(qū)人群中攜帶易感基因或暴露環(huán)境危險(xiǎn)因素的個(gè)體；研究候選神經(jīng)保護(hù)劑（如 EGCG、姜黃素等）對(duì)上述基因及其編碼蛋白在外周和中樞表達(dá)的影響，分析其保護(hù) DA 神經(jīng)元的機(jī)制，找出其神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 作用關(guān)系對(duì) NMS 的影響，在原代細(xì)胞及動(dòng)物水平上研究其作用機(jī)制。 4. 闡明α Syn 基因與環(huán)境毒素的相互作用對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷及 NMS 的作用機(jī)制；初步描繪αSYN 與環(huán)境毒素機(jī)制線路；預(yù)期隨訪到 200 例新發(fā) PD 與 400 例出現(xiàn) NMS 的個(gè)體；預(yù)期建立不同年齡段各動(dòng)物模型不同部位組織樣本庫。 2. 力爭在 vav 研究中取得成果發(fā)表論文；闡述翻譯后修飾對(duì) PD 相關(guān)蛋白的功能影響以及其在疾病發(fā)生中的作用；初步獲得具有保護(hù)作用的化合物；膠質(zhì)細(xì)胞通過iNOS 的激活參與神經(jīng)元鐵代謝。 3. 繼續(xù)研究 敲除對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、致炎因子生成與釋放的影響及其與 DA 能神經(jīng)元損傷的相關(guān)性；應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞 條件敲除鼠，研 究 通道對(duì) PD 時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)及其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；在PHOX/MMP9 基因敲除鼠中觀察MPTP/6OHDA/LPS 對(duì) DA 能神經(jīng)元損傷、 DA 含量和動(dòng)物行為學(xué)的影響 ,檢測膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平的變化；研究干預(yù) p75Trk、 p75sortilin 途徑作為神經(jīng)保護(hù)治療新靶點(diǎn)的價(jià)值、及其相關(guān)的表達(dá)調(diào)控因素和激活機(jī)制 ； 檢測不同時(shí)間點(diǎn)自噬的信號(hào)通路 Beclin1， mTor 的變化與膠質(zhì)細(xì)胞活化的時(shí)相關(guān)系 。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 1. 繼續(xù)篩選、隨訪追蹤社區(qū)人群中攜帶易感基因或暴露環(huán)境危險(xiǎn)因素的個(gè)體；進(jìn)一步收集 PD 家系，利用已建立的 PD 致病基因突變檢測技術(shù)平臺(tái)對(duì)收集的家系進(jìn)行已知致病基因的突 變篩查 并鑒定 ；研究上述基因編碼蛋白在外周血的增齡性變化以及與 PD 病理進(jìn)展之間的關(guān)系；進(jìn)一步在環(huán)境毒素所致 PD 模型猴研究 中 判定上述蛋白在外周表達(dá)的變化作為 PD 早期診斷標(biāo)志物的可能性。 3. 闡明 質(zhì)釋放及其膠質(zhì)傳遞的調(diào)節(jié)在PD 發(fā)生發(fā)展中的作用；闡明介導(dǎo)的免疫炎癥的調(diào)節(jié)及其與PD 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性；確定 PD時(shí) PHOX/MMP9 的表達(dá)以及在黑質(zhì) 紋狀體系統(tǒng)中的分布是否與小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度一致；闡明PHOX/MMP9 受 MAPKs/NFkB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的機(jī)制；闡明活化小膠質(zhì)細(xì)胞釋放 proNGF、proBDNF 等 前 體分 子、 激 活p75sortilin 途徑和相關(guān)下游信號(hào)、誘導(dǎo) DA 能神經(jīng)元凋亡的作用 ； 明確 αSyn 和 PINK1 引起氧化應(yīng)激和自噬與膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系 。 1. 初步完成對(duì)選定社區(qū)人群易感基因和環(huán)境危險(xiǎn)因素暴露的調(diào)查情況，掌握易感或高危人群；爭取發(fā)現(xiàn) 12個(gè)與 PD相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因或多態(tài)性；證明環(huán)境毒素如何在衰老基礎(chǔ)上加重 PD 致病基因編碼蛋白的修飾和對(duì)線粒體功能的影響與機(jī)制。 3. 繼續(xù)研究 敲除對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放 DSerine/ATP/Glu 等膠質(zhì)遞質(zhì)傳遞的影響及其與 PD 的相關(guān)性；應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞 敲除鼠，制備 MPTPPD 模型；分析調(diào)控 PHOX/MMP9 表達(dá)和功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；研究活化小膠質(zhì)細(xì)胞的 proNGF、 proBDNF 等神經(jīng)營養(yǎng)因子前體分子的合成分泌、誘導(dǎo) DA 能神經(jīng)元凋亡作用、p75sortilin 途徑、及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 ；通過 檢測 LC3II 的水平，確定自噬水平與膠質(zhì)細(xì)胞活化的 關(guān)系 。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. 篩 選、隨訪追蹤社區(qū)人群中攜帶易感基因或暴露環(huán)境危險(xiǎn)因素的個(gè)體；進(jìn)一步收集 PD 家系，利用已建立的 PD 致病基因突變檢測技術(shù)平臺(tái)對(duì)收集的家系進(jìn)行已知致病基因的突變篩查 并 鑒定；在不同年齡模型猴研究環(huán)境毒素（ MPTP、魚藤酮）對(duì) PD 致病基因及編碼蛋白表達(dá)以及化學(xué)修飾的影響，研究上述蛋白與環(huán)境毒素相互作用對(duì)線粒體功能的影響及其機(jī)制。 4. 明確 NMS 老年人群 中 ， NMS 與環(huán)境、遺傳交互作用的規(guī)律和特點(diǎn)；確定其在 PD 早期預(yù)警和早期診斷中的作用和意義；發(fā)現(xiàn)不同風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的社區(qū)老年人群；建立不同年齡段動(dòng)物模型的病理組織庫。 5. 顯像探針的臨床前藥理藥效學(xué)研究；建立新探針的生物評(píng)價(jià)方法與篩選方法；評(píng)價(jià) calpain 切割GSK3β這一事件在 PD 發(fā)生中的作用； 體外建立神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察藥物對(duì)神經(jīng)元的營養(yǎng)、對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用 ；定向誘導(dǎo) iPS細(xì)胞定向分化為 DA 能神經(jīng)元。 3. 闡明 質(zhì)細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)及其與 PD 的相關(guān)性；明確 PD 時(shí)黑質(zhì) 紋狀體 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 件敲除鼠，制備 MPTPPD 模型；分別應(yīng)用內(nèi)外源性神經(jīng)毒素MPTP/6OHDA/LPS 建立炎癥和氧化應(yīng)激 PD 動(dòng)物模型；研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的 BDNF 等神經(jīng)營養(yǎng)因子合成分泌、 DA 能神經(jīng)元和 DA前體細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)、 p75Trk 介導(dǎo)途徑、及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 ； 檢測 Bcl2 上游分子 PP2A 或JNK 對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的活化的影響 。 3. 應(yīng)用 敲除鼠，研究 PD 時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制；應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞 條1. 發(fā)現(xiàn) 1 個(gè)新的與 PD 相關(guān)的基因和基因突變；得出攜帶不同風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)?PD 患者臨床表型、疾病進(jìn)展和藥物療效反應(yīng)的影響的相關(guān)數(shù)據(jù)；闡明 PD 致病基因編碼蛋白的修飾對(duì)線粒體功能影響的機(jī)制。 第 二 年 1. 進(jìn)一步收集 PD 家系，利用已建立的 PD 致病基因突變檢測技術(shù)平臺(tái)對(duì)收集的家系進(jìn)行已知致病基因的突變篩查，鑒定新的與 PD相關(guān)的基因和基因突變；比較攜帶不同風(fēng)險(xiǎn)基因 PD 患者的臨床表型、疾病進(jìn)展和藥物療效反應(yīng)的影響；分析 PD 致病基因α Syn的磷酸化和硝基化以及 LRRK2 磷酸化對(duì)衰老過程中線粒體功能的影響。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 抑制劑的治療作用；在 PD 模型中觀察中藥療效； 完善 iPS 細(xì)胞的誘導(dǎo)、增殖、向神經(jīng)干細(xì)胞分化、神經(jīng)干細(xì)胞分選和體外擴(kuò)增的方法體系 。 基于腦內(nèi) 膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)節(jié) ， 闡明 PD 時(shí) DA 能神經(jīng)元選擇性損傷的細(xì)胞和分子機(jī)制 ； 初步闡明 PD 動(dòng)物模型黑質(zhì) 紋狀體系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化對(duì) p75Trk 、p75sortilin 細(xì)胞生存和凋亡途徑的影響問題 ； 證實(shí) PINK1和 α Syn基因異常表達(dá)與膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系 。 2. 對(duì) Hsp22 的作用做出初步評(píng)價(jià)；確認(rèn) DA 受體的作用，并研究膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞機(jī)理；獲得αSYN、 DJ Omi、 Parkin 和 PINK的野生型和突變體的表達(dá)載體及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；建立Knockdwon 體系并進(jìn)行功能研究； IRPs 的異常激活是通過 PKC的活化進(jìn)而引起 IRPs 的磷酸化所致。 4. 在已建立的 PD 和社區(qū)老年人群隊(duì)列中，通過回顧性病例 對(duì)照研究，分析 PD 患者各種 NMS 分布特點(diǎn)及其相關(guān)基因（ Tau、α Syn或 LRRK2）和環(huán)境因素，了解其與 PD 疾病進(jìn)展、預(yù)后以及藥物療效反應(yīng)的關(guān)系；建立各種動(dòng)物與細(xì)胞相關(guān)模型。 2. 純化 Hsp22 Tg 與 knockout 小鼠；研究 DA 受體對(duì) DA 神經(jīng)元變性的作用； PD 相關(guān)蛋白表達(dá)載體構(gòu)建； Knockdown 實(shí)驗(yàn)研究 Omi、Parkin 和 PINK 對(duì)線粒體復(fù)合物 I活性的影響和抑制作用 ； 觀察激活的 PKC 亞型，以及 PKC 激活引起的 IRPs 的磷酸化水平，并在IRP1/IRP2 基因敲除的動(dòng)物上進(jìn)一步證實(shí)上述研究內(nèi)容。 總之， 本項(xiàng)目 已 具備了完成預(yù)期目標(biāo)的可行性。原 973 項(xiàng)目在科技部的領(lǐng)導(dǎo)下，在領(lǐng)域?qū)＜医M的直接支持幫助下，充分發(fā)揮項(xiàng)目專家組的引領(lǐng)作用，項(xiàng)目組內(nèi)已經(jīng)形成了良好有效、團(tuán)結(jié)奮進(jìn)的協(xié)作氛圍，建立了高效完善的管理監(jiān)督體系，秉承了實(shí)事求是的科學(xué)精神。他們都是全職在國內(nèi)工作的、精力充沛的中青年研究工作者，對(duì)科學(xué)研究態(tài)度積極，注重創(chuàng)新，是我國在 PD 研究領(lǐng)域中的中堅(jiān)力量，均多年從事 PD 基礎(chǔ)和臨床研究，已建立了相關(guān)的研究體 系和技術(shù)平臺(tái)，技術(shù)方法全面，主要儀器設(shè)備齊全，對(duì)本項(xiàng)目的開展起積極推動(dòng)作用。 在早期診斷和干預(yù)策略領(lǐng)域研究中： （ 1）已設(shè)計(jì)合成了靶向 DAT 及 VMAT2 的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新化合物， 并已基本完成臨床前研究，具有良好應(yīng)用前景；（ 2）已發(fā)現(xiàn)多種具有抗 PD 作用的候選藥物和若干潛在的藥物作用靶點(diǎn)；（ 3） 已建立了誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的慢病毒體系及體內(nèi)外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向 DA 能神經(jīng)元分化的方法體系。 在 DA 能神經(jīng)元選擇性和進(jìn)行性變性死亡機(jī)制的研究中： （ 1）用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，已在 PD 患者黑質(zhì)中找到多個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)；（ 2）在 PD 動(dòng)物模型黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)鐵過度聚集的新機(jī)制；（ 3）發(fā)現(xiàn) αSYN 在線粒體的異常聚集是導(dǎo)致線粒體功能障礙的新機(jī)制；（ 4）初步揭 示了神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的 、 通道、 PHOX 、 MMP proNGF、 proBDNF 等關(guān)鍵分子異?？蓪?dǎo)致 DA 能神經(jīng)元生存穩(wěn)態(tài)的改變及進(jìn)行性變性死亡。 可行性分析： 本項(xiàng)目是在原 973 項(xiàng)目 主要研究工作的基礎(chǔ)上，經(jīng)過分析該領(lǐng)域國內(nèi)外研究現(xiàn)狀后提出的，具有扎實(shí)的工作基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)，有較強(qiáng)的目的性和可行性。 新體系： 匯集國人特有風(fēng)險(xiǎn)基因、生物標(biāo)記物、臨床非運(yùn) 動(dòng)癥狀和影像學(xué)新探針 等綜合指標(biāo)，通過本項(xiàng)目的充分驗(yàn)證，形成較完善的 PD 早期 預(yù)警和早期診斷的綜合體系。 承擔(dān)單位： 中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 黎明濤 課題參加人員： 周江寧、朱霖、段維明 經(jīng)費(fèi)比例： %各課題之間相互關(guān)系 研究方案與技術(shù)路線： 課題 1：老化、遺傳及環(huán)境因素在 帕金森病 發(fā)病中的作用及機(jī)制研究 課題 2：黑質(zhì) 多巴胺 能神經(jīng)元選擇性變性的特征及機(jī)制研究 隨訪 動(dòng)態(tài)對(duì)比 PD風(fēng)險(xiǎn)基因突變或多態(tài)性篩查 中國人群 PD 風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn) 社區(qū)老年人群 PD 患者 高風(fēng)險(xiǎn) 低風(fēng)險(xiǎn) 風(fēng)險(xiǎn)變異攜帶者 未攜帶者 臨床、影像、嗅覺綜合評(píng)估 臨床表型 影像改變 治療反應(yīng) 疾病進(jìn)展 遺傳因素對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響 風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)Ρ硇秃图膊∵M(jìn)展的影響 基因 環(huán) 境 老化相互作用規(guī)律 多位點(diǎn)聯(lián)合分析 風(fēng)險(xiǎn)基因相互作用模式 涉及多風(fēng)險(xiǎn)基因的分子通路 風(fēng)險(xiǎn)基因突轉(zhuǎn)基因猴模型 風(fēng)險(xiǎn)基因和環(huán)境因素對(duì)多巴胺神經(jīng)元影響機(jī)制 風(fēng)險(xiǎn)基因變異與環(huán)境因素相互作用參與 PD發(fā)病的分子機(jī)制 隨訪 環(huán)境暴露因素調(diào)查 環(huán)境 因素干預(yù) DA能神經(jīng)元選擇性死亡 PD所致特異性異常修飾 （磷酸化、 SUMO化） 線粒體 功能障礙 蛋白異常聚集 鐵離子 選擇性聚集 鐵離子攝入 和轉(zhuǎn)出障礙 黑質(zhì) /腹側(cè)被蓋區(qū)差異表達(dá)蛋白 HSP22等 黑質(zhì)對(duì)損傷的易感性增高 易感性增高 已知 的差異 表達(dá)的蛋白 PD致病蛋白 (DJ1等 ) 與 3 組交叉：膠質(zhì) 細(xì)胞的作用 選擇定位于線粒體 基因敲除 或轉(zhuǎn)基因 免疫組化 CoIP/基因敲減 基因敲減