【正文】 結(jié)點(diǎn)上。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 五 年 1. 構(gòu)建植物 PTI 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 明確 PRR 受體蛋白及互作蛋白的信號傳導(dǎo)途徑。 14. 發(fā)表 SCI 收錄論文 2024 篇 。 12. 獲得同時攜帶 xa Xa2 Pid2 和Pid3 基因的水稻雜合種子 。 稻瘟病、小麥條銹病或小麥白粉病的株系 510 個 ； 獲得新的 Pigm9 抗病位點(diǎn) 23 個；用以改良感病高產(chǎn)水稻品種 10 個。 14. 利用基因標(biāo)記，開展水稻回交轉(zhuǎn)育過程的四親本雙交（具有相同回交親本的個體之間），獲得同時攜帶 xaXa2 Pid2 和 Pid3 基因的雜合種子 。 12. 利用攜帶 xa5Xa21Pid2Pid3 或Yr10Yr18Yr36 聚合載體并呈現(xiàn)新型抗病特征的轉(zhuǎn)基因植株，綜合評價 多基因的聚合表達(dá)對受體 產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響。 10. 利用轉(zhuǎn)基因手段對抗病及激素crosstalk 通路進(jìn)行設(shè)計和改造，培育既增強(qiáng)抗性，又不影響生長發(fā)育的水稻株系 ； 完成 2 個水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的工作 ； 新廣譜抗病基因（ QTL）的功能鑒定工作 ； Pigm/ROD的 supprosser 突變的功能鑒定工作 ；完成抗銹病 QTL 研究 ； 抗黃萎病相關(guān)基因 的 研究。 10. 設(shè)計另外兩套多基因聚合轉(zhuǎn)化或 分子標(biāo)記聚合育種的模式；獲得高抗水稻 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 用的功能機(jī)制，建立病原信號識別與發(fā)育之間的聯(lián)系途徑 ； 鑒定及獲得 上述轉(zhuǎn)基因水稻株系，分析其對病 原 菌抗病或是感病的變化，對上述水稻材料分別進(jìn)行乙烯和 MCP 處理，揭示在該相關(guān)基因表達(dá)背景下，乙烯與 MCP的作用對于感病過程是否依然重要。 8. 進(jìn)一步闡明乙烯在水稻抗稻瘟病中的功能及與產(chǎn)量性狀之間的關(guān)系。 6. 獲得具有潛在育種前景的水稻材料或株系 23 個。 4. 得到宿主作物細(xì)胞在活體 /半活體 病原侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組 ； 建立體外酶促產(chǎn)生苜蓿根瘤菌 EPS胞外寡聚體的技術(shù)方法。 2. 找到 SAR 信號通路相關(guān)分子；確定新蛋白與已知蛋白的關(guān)系 ； 闡明一個完整的參與抗病的 MAPK 蛋白激酶級聯(lián)。 7. 進(jìn)行病 毒侵染前后靶基因相關(guān) siRNA northern blot、測序檢測；靶基因 DNA甲基化測序、 Southern blot 檢測和信息學(xué)分析；和上述在目標(biāo)突變體的研究結(jié)果相比較，研究突變體和病毒侵染對靶基因甲基化改變的相關(guān)性 ； 根據(jù)第 13 年的研究結(jié)果進(jìn)一步研究RNA 干擾的作用機(jī)理及其在抗病毒中的作用 ； 利用過表達(dá)人工 miRNA 等轉(zhuǎn)基因方法對 23 個水稻小 RNA 介導(dǎo)的抗病反應(yīng)進(jìn)行驗證 。 5. 從蛋白生化反面分析 Pigm與 OsSGT1，BBI1， OsRAR1， OsNPR1 是否存在互作，結(jié)合遺傳的數(shù)據(jù)，建立 Pigm 的基礎(chǔ)抗病防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。 4. 利用酵 母雙雜及免疫共沉淀技術(shù)，尋找其他參與 R 蛋白下游傳導(dǎo)的蛋白 及其他參與 SAR 下游傳導(dǎo)的蛋白 ； 深入解析 MEKK1 結(jié)合蛋白、 FLS2 介導(dǎo)的磷酸化蛋白的功能。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白作用及機(jī)制分析 ； 效應(yīng)蛋白靶蛋白的功能分析 ；抗病蛋白互作蛋白的功能鑒定及分子生物學(xué)研究 ； 抗病基因和無毒基因互作的分子機(jī)制研究。 15. 申請專利 1012 項。 13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 23 株；獲得Pigm9 位點(diǎn)純合的單株 23 個。 11. 分析 OsNPR1 介導(dǎo)的 SA 與生長素途徑之間的 crosstalk 及關(guān)鍵因子功能 ； 發(fā)表關(guān) 于 ROD 基因研究工作的論文 ； 發(fā)表水稻抗白葉枯病基因（ QTL）功能相關(guān)的論文 ； 克隆 2 個新的廣譜抗病基因（ QTL） ； 克隆至少一個 Pigm/ROD的 supprosser 突變基因 ； 克隆一個新的抗銹病 QTL。 9. 對乙烯途徑與水稻抗稻瘟病反應(yīng)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能分析。 7. 找出參與抗病毒的 水稻 關(guān)鍵的 RNA干擾途徑的主要組份 ； 明確候選小RNA 的靶標(biāo)基因，及 Xoo 誘導(dǎo)的水稻小 RNA 是否依賴 RNA 沉默途徑。 11. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥 Yr Yr18 和 Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。 利用突變、剪切或重組等手段獲得的新型 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因，構(gòu)建各自的自然表達(dá) 載體并轉(zhuǎn)化到 水稻品種明恢系列或小麥品種濟(jì)麥等系列 ； 水稻Pigm9 新位點(diǎn)的 功能評價。 利用攜帶新型等位基因（ PID Yr Yr18 和Yr36 等 ）的轉(zhuǎn)基因植株，確定轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式 ； 小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗證。 7. 利用 RNAi和過表達(dá)方法對 SA 與生長素途徑之間具有重要作用的基因進(jìn)行分析，闡明其遺傳學(xué)功能。 6. 明確 35 個在宿主作物 禾谷鐮孢互作中起作用的重要基因 ； 初步揭示活性EPS 寡聚體對宿主植物抵抗病源菌入侵的作用 ； 明確靶基因?qū)Σ《厩秩镜膽?yīng)答效應(yīng)，及其參與的抗性途徑機(jī)制 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 鐮孢應(yīng)答基因在植病互作中起重要作用 ； 用不同的 EPS 寡聚體處理宿主植物，接種病源菌，觀察其侵染能力的變化。 4. 確定 12 個 SAR 突變體的突變位點(diǎn) ；解析連接 MEKK1 與 PRR 受體 FLS2 的蛋白組份。 2. 克隆 12 個新的 bir1, snc1, snc2, 等的抑制子基因。分析 LPS 結(jié)合蛋白和 LPS 受體在病原識別和植株發(fā)育過程中的功能。 水稻MAPK 突變體， RNAi 植株純合及抗病分析。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的糖基化分析及表型分析 ； 效應(yīng)蛋白靶蛋白的分離鑒定 ； 抗病蛋白互作蛋白的篩選 ；抗病基因和無毒基因互作的分子機(jī)制研究。 15. 申請專利 78 個。 13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 23 株 。 11. 通過突變、剪切或重組，創(chuàng)建 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因 的新型設(shè)計抗病基因 ； 水稻 Pigm 與 Pi9 基因重組位點(diǎn)的創(chuàng)建 ； 繼續(xù)水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育 ； 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥 Yr Yr18 和Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。 對上年度獲得的新型抗病等位基因（ PID Yr Yr18 和 Yr36 等 ），構(gòu)建 自然表達(dá) 載體并 轉(zhuǎn)化到 水稻或小麥 中； 小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗證。 12. 創(chuàng)建 PID Yr Yr18 或 Yr36 基因 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 具有 crosstalk 功能的候選基因。 9. 篩選并獲得水稻 OsNPR1 基因調(diào)控的信號途徑下游成分并對其進(jìn)行遺傳分析。 7. 分析乙烯反應(yīng)被阻斷后對水稻抗病性的影響及相關(guān)表型變化。 5. 明確病毒 參與抗性 TGS 目標(biāo)蛋白 靶基因 DNA 甲基化的作用三者互作關(guān)系和調(diào)控模式 ； 得到一整套針對水稻RNA干擾途徑主要基因的穩(wěn)定的 RNAi突變體株系。 3. 初步定位 12 個 SAR 突變體 ； 解析MEKK1 結(jié)合蛋 白 ； 初步建立鑒定 Pigm的抗病防衛(wèi)反應(yīng)基礎(chǔ)信號網(wǎng)絡(luò)體系。 再克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 12個，并認(rèn)識病原效應(yīng)蛋白基因的功能，分離其植物體內(nèi)的靶標(biāo)基因 35 個；鑒定抗病蛋白復(fù)合體組份 23 個，明確植物 NBLRR類抗病蛋白分子間的相互作用及對其功能的影響；找到bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子基因 34 個。 鑒定及獲得組成性乙烯反應(yīng)的水稻材料株系；分析在組成性乙烯發(fā)育水稻株系中，具有抗性或是具有感病性水稻對病 原 菌侵染的反應(yīng)及病斑程度 。 7. 利用生物信息學(xué)方法對 Xoo侵染水稻獲得的小 RNA 進(jìn)行分類 ， 預(yù)測小 RNA的靶基因 ； mRNA 表達(dá)譜分析。 5. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮 孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；分析其免疫應(yīng)答與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點(diǎn) /關(guān)鍵分子 ； 通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法篩選活性 EPS 寡聚體誘導(dǎo)表達(dá)的宿主植物基因。 3. 利用圖位克隆和高通量測序技術(shù)鑒定bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子所在的突變位點(diǎn) ； 對 SAR 突變體進(jìn)行表型分型及初定位 ； 進(jìn)行 MEKK1免疫共沉淀 。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. PTI 通路新基因的克隆、鑒定 ； PRR 受體蛋白互作蛋白篩選。 14. 發(fā)表 SCI 文章 10 篇左右。 12. 構(gòu)建 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和Yr10Yr18Yr36 聚合載體各 1 個 。 Yr18 和 Yr36 新型等位基因 35 個。 8. 獲得乙烯耐受水稻株系，對多種致病稻瘟病菌進(jìn)行感病分析；利用 MCP處理，分析抗性水稻在喪失乙烯反應(yīng)后對相應(yīng)的稻瘟病菌發(fā)生的抗性變化 ； 將乙烯耐受基因?qū)肟剐缘乃酒贩N；將造成組成性乙烯反應(yīng)將有轉(zhuǎn)入感病水稻品種以及抗病水稻品種中，獲得相關(guān)的組成性乙烯反應(yīng)水稻材料 ； 分析過表達(dá) OsNPR1 基因不同株系的抗病性及其它與生長發(fā)育有關(guān)的表型。 7. Xoo誘導(dǎo) 水稻小 RNA 的 Solexa 測序建立 miRNA 與 siRNA 表達(dá)譜 。 9. 精細(xì)定位抗銹病 QTL；克隆 2 個抗黃萎病相關(guān)基因。 7. 分析乙烯對水稻抗 抗病性 的作用，構(gòu)建相應(yīng)的水稻研究株系。 5. 明確擬南芥中參與抗病的表觀遺傳途徑相關(guān)蛋白； 明確 Xoo 誘導(dǎo) 或抑制 水稻表達(dá)的特異小 RNA 和 mRNA； 獲得針對 RDR2， DCL3， DCL1， DCL4， AGO1和 AGO4 等 的 RNAi 突變體株系。 3. 篩選到 5 個組成型抗病突變體的相關(guān)抑制子；建立 SAR 篩選體系；完成對SARD1 及 SARD2 的生化功能分析；篩到多個 spi 感病突變單株。 6. 建立病毒侵染水稻的研究體系 ， 構(gòu)建針對水稻 RNA 干擾途徑主要基因的轉(zhuǎn)基因 RNAi 突變體株系 ， 包 括1. 分離鑒定 PTI 途徑基因 12 個；分離鑒定 ETI 途徑基因 12 個；克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 12 個； 得到與MEKK1 結(jié)合的候選蛋白； 鑒定抗病蛋白下游組份 12 個；明確植物抗病蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。建立分離 LPS 結(jié)合蛋白的生物化學(xué)標(biāo)記體系。 3. 對 bir1,snc1,snc2,snc4， mkk1 mkk2 這5 個組成型抗病的突變體做抑制子篩選 ； 對抑制子進(jìn)行表型分析及初定位 ；建立 SAR 篩選體系，分析 SARD1 及SARD2 的生化功能 ； 擬南芥 MEKK1 結(jié)合蛋白酵母雙雜交篩選。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 擬南芥 PTI 相關(guān)突變體的篩選； PRR受體蛋白酵母雙雜交庫的構(gòu)建 ； 抗病蛋白系列置換突變體構(gòu)建與功能分析 ；水稻抗病蛋白與病原菌效應(yīng)蛋白基因的 克隆。 此外，項目組大部分骨干都曾在國際上著名的實驗室中從事植物分子生物學(xué)和植物病理學(xué)工作多年，在國內(nèi)建立了優(yōu)秀的實驗室，并和國際權(quán)威人士建立了良好的交流與合作關(guān)系。 Microbes, PLoS Pathogens， Journal of Virology, Plant Journal, Plant Physiology, Molecular MicrobePlant Interaction 等。本項目組織的骨干隊伍集中了國內(nèi)優(yōu)勢的研究單位，研究方向全面、合理，分別涉及到農(nóng)作物抗病、真菌病害、細(xì)菌病害、病毒病害等本領(lǐng)域重點(diǎn)分支，在多個研究領(lǐng)域如水稻功能基因組學(xué)、植物免疫、作物抗病性、病原菌基因組學(xué)、表觀遺傳等方面做出了一系列突破性的研究成果。在植物免疫途徑（ PTI， ETI）及其互作、植物免疫的表觀遺傳調(diào)控、SAR 調(diào)控、作物廣譜抗病基因的功能機(jī)制及其育種應(yīng)用、水稻抗紋枯病等方面可望 有重大的突破性成果。一些前期研究已經(jīng)處于穩(wěn)步開展階段，多個作物主要抗病基因和擬南芥免疫關(guān)鍵調(diào)控基因已經(jīng)克隆，植物表觀遺傳機(jī)制已有重大新發(fā)現(xiàn)，為本項目的順利實施提供了有力保障。 4. 研究基礎(chǔ)較好 。其它相關(guān)的平臺 , 如表觀遺傳、蛋白組學(xué)、表達(dá)組學(xué)、生物信息學(xué)、植物病理學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞生物學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)研究手段均已建立并不斷改進(jìn)。 3. 技術(shù)路線成熟。 我國主要農(nóng)作物栽培歷史長，栽培區(qū)域差異大，抗病性資源豐富，并具有較高的抗病育種水平。 1. 項目有廣泛共識 ：本項目已經(jīng)經(jīng)過 3 年多的籌備 ，尤其通過 2020 年 5 月第 349 次 香山科學(xué)會議 《植物先天免疫機(jī)