【正文】 和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響 ， 分析相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；應(yīng)用生物信息學(xué)、蛋白功能域分析鑒定和單克隆抗體封閉等技術(shù)，1. 對社區(qū)人群中存在危險遺傳基因和環(huán)境暴露個體進(jìn)行檢查和確診；發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)劑保護(hù) DA 神經(jīng)元的潛在靶點(diǎn)。 4. 最終明確 PD 患者 PDD 等 NMS 的發(fā)生率、病因、發(fā)生機(jī)制、與臨床進(jìn)程的關(guān)系；了解各因素與 PD疾病進(jìn)展、預(yù)后以及藥物療效反應(yīng)的關(guān)系；尋找檢測 PDD 等 NMS發(fā)生的敏感指標(biāo)、基因位點(diǎn)及相關(guān)量表；綜合藥物和認(rèn)知康復(fù)的結(jié)果，建立系統(tǒng)的干預(yù)方案；闡明與 NMS 發(fā)生相關(guān)的因素及其機(jī)制。 6. 對本課題的實驗結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)整理，進(jìn)行項目的總結(jié)和 成果鑒定。 圍繞這一核心問題，我們將回答的具體問題和主要研究內(nèi)容是： 老化 、 遺傳 和 環(huán)境 是 觸發(fā) PD 的關(guān)鍵因素。 探討黑質(zhì)特異表達(dá)的蛋白質(zhì)異常與金屬離子選擇性聚集以及線粒體功能障礙等環(huán)節(jié) 相互 作用 在 DA 能 神經(jīng)元選擇性變性死亡中的作用；闡明神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞 網(wǎng)絡(luò) 功能失衡在神經(jīng)元選擇性 、進(jìn)行 性變性 死亡 中的作用機(jī)制。 根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，完善基于 PD 的特異突變基因和風(fēng)險基因 、生物標(biāo)記物、 NMS 和分子影像 探針等為基礎(chǔ)的預(yù)警和早期診斷的指標(biāo)體系；進(jìn)一步研究和驗證具有自主知識產(chǎn)權(quán)的候選化合物 /候選靶標(biāo)，開展靈長類 PD 模型的 iPS 細(xì)胞治療的相關(guān)研究。 五年預(yù)期目標(biāo)： 發(fā)現(xiàn)一批新的組蛋白修飾因子 ， 探明 組蛋白修飾與 DNA 甲基化之間相互作用的分子機(jī)制， 篩選一批 腫瘤相關(guān) ncRNA，鑒定一批具有潛在臨床應(yīng)用價值的腫瘤診斷及治療的新的 ncRNA 分子靶標(biāo)；鑒定一批新的 EMT 關(guān)鍵調(diào)控因子 ；發(fā)現(xiàn)針對轉(zhuǎn)移型乳腺癌、肺癌的新的有效治療靶點(diǎn)。 三、研究方案 本項目分為 六 個課題，將全面系統(tǒng)地研究乳腺癌和肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳 機(jī)制 ， 為 乳腺癌和肺癌的預(yù)防、診斷、治療提供分子標(biāo)志及 藥物 靶標(biāo)。篩選出影響 DNA 甲基化酶和 DNA 結(jié) 合的關(guān)鍵性因子或蛋白；明確相關(guān)關(guān)鍵性因子 或 蛋白與 DNA 甲基化酶及 DNA 結(jié)合蛋白作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步明確特定基因發(fā)生 DNA 甲基化的分子機(jī)制，進(jìn)而揭示組蛋白修飾 與 DNA 甲基化 相互作用 的分子機(jī)制。本研究將在開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，篩選并鑒定出影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵性 DNA 甲基化變化位點(diǎn)及其網(wǎng)絡(luò)，了解其在癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力重編程過程中作用，建立預(yù)測惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力的表觀遺傳分子分型體系。在此基礎(chǔ)上，利用動物模型和臨床標(biāo)本對組蛋白修飾候選因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用做深入分析。與此同時，選擇其中一些有重要功能的ncRNA， 結(jié)合大量的腫瘤患者的標(biāo)本及臨床資料， 研究將其作為藥靶或生物標(biāo)記物的可能性。在此基礎(chǔ)上，對差異表達(dá)的新基因及特異性組蛋白修飾酶在 EMT 以及在乳腺癌轉(zhuǎn)移及藥物耐受中的作用做深入分析。建立可誘導(dǎo)表達(dá)熒光標(biāo)記的 Ecadherin 或其它 EMT 誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以在細(xì)胞及分子水平上實時觀察細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變對 EMT 及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。 具體方案如下： 課題 負(fù)責(zé)人： 劉芝華，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 學(xué)術(shù)骨干： 李曉濤，華東師范大學(xué)生命科學(xué)研究所 曲春楓，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 課題六：惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用腫瘤基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，采用計算生物學(xué)方法推測在惡性腫瘤、干細(xì)胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對于大規(guī)模因果mRNA及 miRNA表達(dá)譜分析 正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組織 建立基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型 明確基質(zhì)細(xì)胞的基因 /miRNA對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) TGFβ 信號通路 /REG?蛋白酶體 動物水平 Smad2 亞等位基因表達(dá)小鼠模型 闡明 REG?蛋白酶體與 TGFβ 信號通路間的相互作用 細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移 基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作 用 分子、細(xì)胞水平 基因 /miRNA的功能研究 基因敲除 建立腫瘤與細(xì)胞微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)體系 腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合體動物模型構(gòu)建 推斷問題，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡(luò)搜索空間的矛盾。通過干擾預(yù)測的上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)后以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù)對下游節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測，對以上預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗證。譬如我們要證實H3K27me3 抑制基因表達(dá)這一關(guān)系，我們可以通過抑制正常細(xì)胞或者癌細(xì)胞的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶或者去甲基化酶來調(diào)節(jié) H3K27me3 水平，從而觀察下游基因表達(dá)水平的變化（圖 2）。 圖 2： 如何通過干擾上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)并以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù) 檢測下游基因驗證預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系 具體方案 如下： 課題 負(fù)責(zé)人：韓敬東，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 學(xué)術(shù)骨干： 吳 旻 ，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 染色質(zhì)與組蛋白的多種表觀遺傳學(xué)修飾 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控關(guān)系 轉(zhuǎn)錄因子的 ChIPseq實驗 基因表達(dá)譜差異分析 染色質(zhì)構(gòu)型分析 表觀遺傳因子 ChIPseq實驗 絕緣子的基因組分布 表觀遺傳因子的基因組分布 轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)基因分布 染色質(zhì)空間形態(tài)與 DNA、組蛋白修飾的因果調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因的 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 多 因 素 SNP 與GWAS分析：鑒定腫瘤發(fā)病相關(guān)的重要基因突變相互關(guān)系 惡性腫瘤發(fā)病因素預(yù)測的因果網(wǎng)絡(luò)模型 RNAi 與基因 敲除研究：驗證腫瘤發(fā)病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與基因的影響范圍 惡性腫瘤高通量數(shù)據(jù)的整合與網(wǎng)絡(luò)的計算預(yù)測 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1） 多種手段研究肺癌細(xì)胞腫瘤抑制基因甲基化狀況，開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化標(biāo)志物研究；開展 PcG 蛋白表達(dá)變異與腫瘤抑制基因表觀遺傳失活關(guān)系研究； 2） 利用高通量芯片、 ChIPChip、ChIPseq、酵母雙雜交、免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，針對 TGFβ和雌激素信號通路相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)錄因子 Smad ER 及其轉(zhuǎn)錄輔助因子，篩選新的組 蛋白修飾基因或 miRNA； 3） 利用 RNASELEXseq 等技術(shù)平臺系統(tǒng)篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的 ncRNA；檢測 ncRNA 的表達(dá)譜； 4） 誘導(dǎo)或抑制 EMT 表型。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 除、 RNA 沉默等 )干預(yù)型實驗數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題。 5） 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞 、 浸潤巨噬 細(xì)胞 、 浸潤的單核巨噬細(xì)胞 ，分析 miRNA及 mRNA的表達(dá)譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌中上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)譜差異 ； 6） 開發(fā)能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。驗證轉(zhuǎn)錄因子對某種組蛋白修飾的作用可以通過過表達(dá)或者 RNAi 轉(zhuǎn)錄因子來直接觀察到。這樣 就可以人為 地 提高或降低上游事件的水平，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達(dá)，或者組蛋白或 DNA 修飾的水平的變化，來證實我們所預(yù)測的因果關(guān)系。 （ 3） 不同系統(tǒng)生物學(xué)因素之間的上下游作用關(guān)系可能會隨腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程而動態(tài)地發(fā)生變化，為此我們擬開發(fā)能夠正確推斷這種動態(tài)關(guān)系的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法。 （ 1） 考慮到實驗方法與手段的多樣性，需要開發(fā)能夠自動整合 并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。分離乳腺 良性增生患者及各種不同類型不同分期的乳腺癌 患者 組織微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞及腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞，分析 miRNA 及 mRNA 的表達(dá)譜；研究這些差異表 達(dá)的基因或 miRNA對成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響； 建立 三維細(xì)胞培養(yǎng) 模型 ，將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內(nèi)環(huán)境，并應(yīng)用免疫分子及免疫細(xì)胞缺陷小鼠構(gòu)建小鼠骨髓嵌合體動物模型，研究這些差異表達(dá)的基因或 miRNA 對共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；采用基因工程小鼠模型， 從分子、細(xì)胞、動物上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)換的機(jī)理 及表觀遺傳機(jī)制 建立低轉(zhuǎn)移性、高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系及人工改變 Ecadherin水平誘導(dǎo)或 抑制 EMT后的細(xì)胞系 尋找高轉(zhuǎn)移性乳腺癌及對現(xiàn)有化療藥物不敏感性的乳腺癌的治療靶點(diǎn) 基因表達(dá)譜差異 ChIPseq檢測主要轉(zhuǎn)錄相關(guān)組蛋白修飾 差異表達(dá)基因總體特征分析 新基因功能分析及特異性組蛋白修飾酶 在EMT中的作用 功能域分析； 質(zhì)譜檢測并驗證相互作用蛋白；靶基因檢測；與已知 EMT基因關(guān)系 病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定過表達(dá)及 shRNA抑制候選基因后，細(xì)胞表型及小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的行為變化 MeDIPseq檢測 DNA甲基化變化 以 TGF?或 TNF?刺激細(xì)胞 或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染?catenin分別誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生 EMT 蛋白質(zhì)譜差異 磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)差異 三個層面研究 TGFβ 信號通路在腫瘤微環(huán)境中與 REG?蛋白酶體激活因子、 p53 等重要腫瘤因子動態(tài)相互作用 及其動態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制。用基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜及全蛋白磷酸化譜分析在三種條件下共同變化的靶基因及蛋白分子。選取永生化的正常乳腺細(xì)胞系（如 MCF10A）， ER 陽性低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系（如 MCF7， T47D 等）， ER 陰性高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系（如 MDAMB231， SUM1315 等），以及 ER 陽性但對三苯氧胺耐藥的 BT474 細(xì)胞等為主要細(xì)胞模型，并通過 lentivirus 介導(dǎo)的 shRNA 抑制或過表達(dá) Ecadherin 在 這些細(xì)胞系中分別誘導(dǎo)或抑制 EMT 表型。本課題將以乳腺癌細(xì)胞系、腫瘤組織、腫瘤啟動細(xì)胞為模型，利用自主建立的 RNASELEXseq 技術(shù)平臺系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)和鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白（特別是其中的轉(zhuǎn)錄因子和表觀修飾酶）發(fā)生相互作用的 ncRNA；還將采用不同大小的 ncRNA的 cDNA 文庫（ sizefractioned RNA library）鑒定腫瘤啟動 細(xì)胞特異的 ncRNA。將以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選乳腺癌和肺癌中發(fā)生突變或者表達(dá)異常的組蛋白修飾酶以及轉(zhuǎn)錄因子，同時針對 MLL1 等相關(guān)的甲基化酶復(fù)合物組分， LSD1 等去甲基化酶 、 EYA 去磷酸化酶和磷酸化激酶、轉(zhuǎn)錄因子 Smad4和 ER 及其轉(zhuǎn)錄輔助因子等，篩選新的組蛋白修飾基因或 miRNA，利用各種蛋白質(zhì)間相互作用方法驗證篩選獲得的組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用。本研究還將以多種器官的正常組織和腫瘤組織為對象，了解正常組織細(xì)胞中 PcG 蛋白的正常組合關(guān)系，研究這種正常組合關(guān)系破壞與腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其 與 腫瘤相關(guān)基因組蛋白修飾、核小體定位和 DNA 甲基化發(fā)生的關(guān)系 。 六個部分各有側(cè)重，又緊密銜接，團(tuán)結(jié)合作，互相促進(jìn)。 培養(yǎng)一批中青年學(xué)術(shù)帶頭人和 學(xué)術(shù) 骨干；培養(yǎng)研究生 （含碩、博） 50 名以上 、博士后 12 名以上 。本項目的總體目標(biāo)如下：闡明 表觀遺傳關(guān)鍵機(jī)制即 DNA 甲基化、 組蛋白修飾 和 非編碼 RNA 對基因表達(dá)調(diào)控的影響 ； 明確表觀遺傳調(diào)控在乳腺癌、肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 ； 揭示EMT 過程中的表觀遺傳學(xué)變化及 細(xì) 胞重編程機(jī)制 ； 闡明細(xì)胞微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制 ； 整合各種信息數(shù)據(jù)，描繪乳腺癌、肺癌 發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 。 利用我們現(xiàn)有的 PD 臨床 數(shù)據(jù)庫、 標(biāo)本庫 及健康社區(qū)老年人群隊列及標(biāo)本 庫，開展回顧性 /前瞻性隊列研究，探討 NMS 在 PD 的發(fā)生率、與臨床病程的相關(guān)性；利用動物模型探討 αSYN 隨齡表達(dá)增加與環(huán)境、遺傳因素相互作用 導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)元功能障礙和 NMS 的機(jī)制，為確立 PD 預(yù)警和干預(yù)的新靶標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。采用前瞻性 /回顧性 研究方法，分析攜帶風(fēng)險基因變異對健康老年社區(qū)人群 PD 發(fā)病風(fēng)險的影響及其與環(huán)境因素交互作用的規(guī)律和特點(diǎn)，以闡明老化、遺傳和環(huán)境因素的共同作用與 PD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 在前期工作 基礎(chǔ)上，結(jié)合目前國際學(xué)術(shù)前沿，從啟動因素、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和漸進(jìn)性加重機(jī)制三個層面，探討老化、遺傳和環(huán)境因素相互作用啟動 DA 能 神經(jīng)元變性死亡的機(jī)制；認(rèn)識黑質(zhì)特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)以及金屬離子異常聚集、線粒體功能障礙等關(guān)鍵環(huán)節(jié)在神經(jīng)元選擇性變性死亡中所起的作用；闡明神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)功能失 衡 最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡進(jìn)行性加重的過程及其機(jī)制；關(guān)注嚴(yán)重影響患者生活 質(zhì)量的 NMS 并開展機(jī)制研究；建立基于遺傳學(xué)、生物化學(xué)、 臨床癥狀學(xué)、 影像學(xué)等為基礎(chǔ)的早期預(yù)警和診斷的指標(biāo)體系；深入研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)或前期工作基礎(chǔ)的具有神經(jīng)保護(hù)作用的先導(dǎo)化合物或候選靶