【正文】 的組蛋白修飾酶以及轉錄因子，同時針對 MLL1 等相關的甲基化酶復合物組分， LSD1 等去甲基化酶 、 EYA 去磷酸化酶和磷酸化激酶、轉錄因子 Smad4和 ER 及其轉錄輔助因子等，篩選新的組蛋白修飾基因或 miRNA，利用各種蛋白質間相互作用方法驗證篩選獲得的組蛋白修飾復合物中各成員間的相互作用。選取永生化的正常乳腺細胞系（如 MCF10A）， ER 陽性低轉移性細胞系（如 MCF7， T47D 等）， ER 陰性高轉移細胞系（如 MDAMB231， SUM1315 等），以及 ER 陽性但對三苯氧胺耐藥的 BT474 細胞等為主要細胞模型，并通過 lentivirus 介導的 shRNA 抑制或過表達 Ecadherin 在 這些細胞系中分別誘導或抑制 EMT 表型。分離乳腺 良性增生患者及各種不同類型不同分期的乳腺癌 患者 組織微環(huán)境中的成纖維細胞及腫瘤相關性巨噬細胞，分析 miRNA 及 mRNA 的表達譜；研究這些差異表 達的基因或 miRNA對成纖維細胞及腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響； 建立 三維細胞培養(yǎng) 模型 ，將腫瘤細胞與基質細胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內環(huán)境，并應用免疫分子及免疫細胞缺陷小鼠構建小鼠骨髓嵌合體動物模型，研究這些差異表達的基因或 miRNA 對共培養(yǎng)后腫瘤細胞侵襲轉移能力的影響；采用基因工程小鼠模型， 從分子、細胞、動物上皮－間質轉換的機理 及表觀遺傳機制 建立低轉移性、高轉移性乳腺癌細胞系及人工改變 Ecadherin水平誘導或 抑制 EMT后的細胞系 尋找高轉移性乳腺癌及對現(xiàn)有化療藥物不敏感性的乳腺癌的治療靶點 基因表達譜差異 ChIPseq檢測主要轉錄相關組蛋白修飾 差異表達基因總體特征分析 新基因功能分析及特異性組蛋白修飾酶 在EMT中的作用 功能域分析； 質譜檢測并驗證相互作用蛋白；靶基因檢測；與已知 EMT基因關系 病毒介導的穩(wěn)定過表達及 shRNA抑制候選基因后，細胞表型及小鼠乳腺癌轉移模型的行為變化 MeDIPseq檢測 DNA甲基化變化 以 TGF?或 TNF?刺激細胞 或 穩(wěn)定轉染?catenin分別誘導癌細胞發(fā)生 EMT 蛋白質譜差異 磷酸化修飾蛋白質組學差異 三個層面研究 TGFβ 信號通路在腫瘤微環(huán)境中與 REG?蛋白酶體激活因子、 p53 等重要腫瘤因子動態(tài)相互作用 及其動態(tài)調控的分子機制。 （ 3） 不同系統(tǒng)生物學因素之間的上下游作用關系可能會隨腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程而動態(tài)地發(fā)生變化，為此我們擬開發(fā)能夠正確推斷這種動態(tài)關系的貝葉斯網(wǎng)絡學習算法。驗證轉錄因子對某種組蛋白修飾的作用可以通過過表達或者 RNAi 轉錄因子來直接觀察到。 研究內容 預期目標 除、 RNA 沉默等 )干預型實驗數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題。譬如我們要證實H3K27me3 抑制基因表達這一關系，我們可以通過抑制正常細胞或者癌細胞的組蛋白甲基化轉移酶或者去甲基化酶來調節(jié) H3K27me3 水平，從而觀察下游基因表達水平的變化（圖 2）。對于大規(guī)模因果mRNA及 miRNA表達譜分析 正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組織 建立基質細胞與腫瘤細胞的三維細胞培養(yǎng)模型 明確基質細胞的基因 /miRNA對腫瘤轉移的影響 腫瘤相關成纖維細胞原代培養(yǎng) TGFβ 信號通路 /REG?蛋白酶體 動物水平 Smad2 亞等位基因表達小鼠模型 闡明 REG?蛋白酶體與 TGFβ 信號通路間的相互作用 細胞微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移 基質細胞、細胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作 用 分子、細胞水平 基因 /miRNA的功能研究 基因敲除 建立腫瘤與細胞微環(huán)境網(wǎng)絡體系 腫瘤相關性巨噬細胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合體動物模型構建 推斷問題，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡搜索空間的矛盾。建立可誘導表達熒光標記的 Ecadherin 或其它 EMT 誘導因子的穩(wěn)定轉染細胞系，以在細胞及分子水平上實時觀察細胞內外環(huán)境的改變對 EMT 及細胞轉移能力的影響。與此同時，選擇其中一些有重要功能的ncRNA， 結合大量的腫瘤患者的標本及臨床資料， 研究將其作為藥靶或生物標記物的可能性。本研究將在開展腫瘤轉移相關 DNA 甲基化組學研究的基礎上，篩選并鑒定出影響腫瘤細胞轉移能力的關鍵性 DNA 甲基化變化位點及其網(wǎng)絡，了解其在癌細胞獲得轉移能力重編程過程中作用，建立預測惡性腫瘤轉移能力的表觀遺傳分子分型體系。 三、研究方案 本項目分為 六 個課題，將全面系統(tǒng)地研究乳腺癌和肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移的表觀遺傳 機制 ， 為 乳腺癌和肺癌的預防、診斷、治療提供分子標志及 藥物 靶標。 根據(jù)前期研究基礎，完善基于 PD 的特異突變基因和風險基因 、生物標記物、 NMS 和分子影像 探針等為基礎的預警和早期診斷的指標體系；進一步研究和驗證具有自主知識產權的候選化合物 /候選靶標，開展靈長類 PD 模型的 iPS 細胞治療的相關研究。 圍繞這一核心問題，我們將回答的具體問題和主要研究內容是： 老化 、 遺傳 和 環(huán)境 是 觸發(fā) PD 的關鍵因素。 4. 最終明確 PD 患者 PDD 等 NMS 的發(fā)生率、病因、發(fā)生機制、與臨床進程的關系；了解各因素與 PD疾病進展、預后以及藥物療效反應的關系；尋找檢測 PDD 等 NMS發(fā)生的敏感指標、基因位點及相關量表；綜合藥物和認知康復的結果，建立系統(tǒng)的干預方案；闡明與 NMS 發(fā)生相關的因素及其機制。 研究內容 預期目標 作用關系對 NMS 的影響，在原代細胞及動物水平上研究其作用機制。 研究內容 預期目標 第 四 年 1. 繼續(xù)篩選、隨訪追蹤社區(qū)人群中攜帶易感基因或暴露環(huán)境危險因素的個體；進一步收集 PD 家系，利用已建立的 PD 致病基因突變檢測技術平臺對收集的家系進行已知致病基因的突 變篩查 并鑒定 ；研究上述基因編碼蛋白在外周血的增齡性變化以及與 PD 病理進展之間的關系；進一步在環(huán)境毒素所致 PD 模型猴研究 中 判定上述蛋白在外周表達的變化作為 PD 早期診斷標志物的可能性。 研究內容 預期目標 第 三 年 1. 篩 選、隨訪追蹤社區(qū)人群中攜帶易感基因或暴露環(huán)境危險因素的個體；進一步收集 PD 家系，利用已建立的 PD 致病基因突變檢測技術平臺對收集的家系進行已知致病基因的突變篩查 并 鑒定；在不同年齡模型猴研究環(huán)境毒素（ MPTP、魚藤酮）對 PD 致病基因及編碼蛋白表達以及化學修飾的影響，研究上述蛋白與環(huán)境毒素相互作用對線粒體功能的影響及其機制。 3. 應用 敲除鼠，研究 PD 時腦內神經再生的調節(jié)作用及其機制；應用星形膠質細胞 條1. 發(fā)現(xiàn) 1 個新的與 PD 相關的基因和基因突變；得出攜帶不同風險基因對 PD 患者臨床表型、疾病進展和藥物療效反應的影響的相關數(shù)據(jù)；闡明 PD 致病基因編碼蛋白的修飾對線粒體功能影響的機制。 2. 對 Hsp22 的作用做出初步評價；確認 DA 受體的作用，并研究膠質細胞相關的細胞機理；獲得αSYN、 DJ Omi、 Parkin 和 PINK的野生型和突變體的表達載體及穩(wěn)定表達細胞系；建立Knockdwon 體系并進行功能研究； IRPs 的異常激活是通過 PKC的活化進而引起 IRPs 的磷酸化所致。原 973 項目在科技部的領導下，在領域專家組的直接支持幫助下，充分發(fā)揮項目專家組的引領作用，項目組內已經形成了良好有效、團結奮進的協(xié)作氛圍，建立了高效完善的管理監(jiān)督體系，秉承了實事求是的科學精神。 可行性分析： 本項目是在原 973 項目 主要研究工作的基礎上，經過分析該領域國內外研究現(xiàn)狀后提出的，具有扎實的工作基礎和理論基礎，有較強的目的性和可行性。以期對 PD 的預警、早診和干預提出新的策略。然而 NMS 在 PD 發(fā)展過程中所起的重要作用以及其具體發(fā)生機制目前尚不清楚。在內外因素的作用下，受損的神經元以及過度激活的膠質細胞將導致神經元所處微環(huán)境的惡化，使神經元的損傷呈現(xiàn)進行性加重態(tài)勢。本研究將在此基礎上，從臨床和基礎兩方面深入探討風險基因之間、基因變異與環(huán)境暴露因素、年齡增長之間的相互作用規(guī)律，以進一步揭示 PD 的分子發(fā)病機制及其對 PD 臨床表型和 疾病進展的影響，探討風險基因在 PD 早期預警和早期診斷中的作用。 （ 3）申請專利 15 項。 項目名稱： 帕金森病發(fā)病機制和干預策略的基礎研究 首席科學家： 王曉民 首都醫(yī)科大學 起止年限： 至 依托部門： 教育部 衛(wèi)生部 項目名稱： 惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的細胞表觀遺傳機制 首席科學家： 尚永豐 北京大學 起止年限： 至 依托部門： 教育部 二、預期目標 總體預期目標 在本項目組已有的前期工作（原 973 項目 “神經變性病的機制和防治的基礎研究 ”）成果和基礎之上，通過對 PD 發(fā)生發(fā)展過程中 DA 能神經元選擇性、進行性變性死 亡的機制研究，對疾病發(fā)生發(fā)展的認識有重大推進，形成新理論，并指導預警、早期診斷、預防和治療，使我國在 PD 的基礎研究和臨床診斷與治療上形成自己的特色，達到國際先進水平。 （ 2）培養(yǎng)博士后 2530 名，博士與碩士生 300320 名。本項目在前期研究中發(fā)現(xiàn)了數(shù)個中國人 PD 獨特風險基因變異及環(huán)境易感因素，但其參與發(fā)病的具體機制尚未闡明。 承擔單位： 中科院上海神經科學研究所 課 題負責人： 周嘉偉 課題參加人員： 謝俊霞、王光輝 、柯亞 經費比例： % 課題 3：神經元 膠質細胞相互作用在 帕金森病 發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究 主要研究內容： 神經元周圍的膠質細胞在維持神經元微環(huán)境的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。 承擔單位： 首都醫(yī)科大學 課題負責人： 王曉民 課題參加人員： 胡剛、陳良為、楊慧 經費比例： %（含首席經費） 課題 4： 帕金森病 非運動癥狀發(fā)生機制及早期臨床預警指標的研究 主要研究內容： 非運動癥狀（ nonmotor symptoms, NMS）作為 PD 臨床表現(xiàn)的重要組成部分，在最近的 PD 臨床與科研研究中受到人們越來越多的關注。同時，研究 PD 干預新策略，包括以 GSK3α /β作為靶標的研究；對中藥單體 T10/天然海洋藥物海帶褐藻硫酸酯 /中藥提取物遠志皂苷的神經保護作用機制，為研發(fā)具有神經保護作用的藥物奠定基礎；以及對 iPS 細胞轉化的神經干細 胞在 PD 細胞治療和抗 PD 藥物篩選中的應用研究。 特色資源： 充分利用已經建立的、具有國際領先水平的全國多中心 PD 患者和社區(qū)老年人群隊列臨床數(shù)據(jù)庫和樣本庫，保證本項目研究工作的創(chuàng)新性和整體性。 本次 973 項目是原 973 項目的延續(xù)。 5. 顯像探針的臨床前藥學研究； αSYN 蛋白和 5HT 能神經元的受體及轉運載體顯像的新分子探針的設計合成 ；以 GSK3α/β 為靶點研究其在 PD 發(fā)病中的作用及其1. 闡明中國人 PD 獨特的風險基因變異之間的相互作用方式；得出上述基因在 PD 早期預警和早期診斷中的作用；初步揭示特定風險基因突變 /多態(tài)性與特定環(huán)境因素及老化之間的交互作用規(guī)律；闡明 PD 致病基因及其編碼蛋白的增齡性變化與 PD 敏感腦區(qū)線粒體功能之間的關系。 2. 研究 HSP22 的作用機理；研究 vav在 DA 神經元的表達和水平的差異對其易感性的影響； Omi、Parkin 和 PINK 對自噬的調控作用；鐵代謝相關蛋白在神經元和膠質細胞中的表達異同；小膠質細胞對其他膠質細胞以及 DA 神經元鐵代謝功能的影響。 5. 按照 SFDA 放射性新藥申報要求完成顯像探針的藥理藥效學研究；篩選所合成的新探針； . 明確 calpain 切割 GSK3β這一事件在 PD 發(fā)生中的作用并獲得 PD 治療短肽；闡明藥物的神經營養(yǎng)和神經保護作用機制是否與抑制小膠質細胞激活、放大星形膠質細胞營養(yǎng)作用有關，初步明確藥物作用的靶細胞類型；穩(wěn)定獲得 iPS細胞定向分化來的 DA 能神經元。 4. 初步分析不同風險等級人群出現(xiàn)NMS 及 PD 的情況；初步分析建模動物病理變化與 NMS 之間的相關性；研究α Syn 等關鍵基因與年齡、以及 NMS 三者之間的關系。 5. 確定顯像探針自動合成工藝；明確藥物有 效劑量的毒性范圍，藥物的半衰期、藥代動力學特點，為進一步的藥物開發(fā)奠定基礎；初步明確 PD 細胞變性死亡機制并篩選出抗 PD 藥物。 4. 分析可知與 PD 疾病進展、預后、藥物療效反應相關因素；分析判斷不同風險人群發(fā)生 NMS 及 PD的風險預測