【正文】 闡明多巴胺對血管抑制因子 /血管生成因子平衡的調(diào)控作用。 研究近視相關(guān)非編碼 RNA 參與及影響的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路 。 為闡明和解決近視發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵科學問題，申請者 提出：首先從紛繁復(fù)雜的視覺線索中篩選出和影響眼球發(fā)育、包括近視發(fā)生相關(guān)的視覺刺激和其它的環(huán)境因素，以及與之相關(guān)聯(lián)的遺傳因素；其次，探索相關(guān)環(huán)境因素（特別是視覺刺激）以及遺傳因素是如何影響視覺信號傳遞及加工通路， 視覺信息加工與處理 異常如何引發(fā) 視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)和鞏膜生化的改變 及其途徑和機制 ，以及兩者是如何相互作用 的機制；進而對環(huán)境和遺傳因素是如何 進一步引起鞏膜細胞外基質(zhì)以及纖維形態(tài)的改變從而導(dǎo)致了近視的發(fā)生，以及在該途徑中視網(wǎng)膜和鞏膜的基因表達和調(diào)控機制進行深入的研究；再者，對這些環(huán)境和遺傳因素是否通過中樞途徑對 視覺信號通路和加工產(chǎn)生影響，如經(jīng)過視網(wǎng)膜的模糊適應(yīng)和調(diào)節(jié)等機制對眼球的發(fā)育進行中樞調(diào)控及機制進行探索性研究；此外，對于病理性近視，除了從上述兩個方面入手外，還需要深入研究視覺信號通路和加工異常對視網(wǎng)膜本身的影響以及其對鞏膜的進一步改變，最終又是如何逆向影響到視網(wǎng)膜等部位，從而產(chǎn)生視網(wǎng)膜等部位的并發(fā)癥。 闡明近視相關(guān)非編碼 RNA 參與及影響的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路 初步闡明外源性應(yīng)用多巴胺或多巴胺受體拮抗劑對病理性近視并發(fā)癥的預(yù)防和治療作用。探討外源性應(yīng)用多巴胺或多巴胺受體拮抗劑等對病理性近視并發(fā)癥的干預(yù)研究。 完成 500： 500 的高度近視樣本的候選基因區(qū)域重測序，確定致病突變和突變組合。 探討多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)對脈絡(luò)膜中血管抑制因子及血管生成因子平衡的調(diào)節(jié)作用。 闡明近視相關(guān)非編碼 RNA 對鞏膜成纖維細胞生物學性狀的影響 闡明多巴胺及其受體系統(tǒng)在正常眼以及病理性近視眼球組織中的表達。采用體外細胞培養(yǎng)方法，探討多巴胺對鞏膜基質(zhì)細胞細胞外基質(zhì)代謝的影響。引進 TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠并繁殖 明確鞏膜細胞外基質(zhì)改變對屈光的影響；尋找影響基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族、膠原基因家族的轉(zhuǎn)錄因子及藥物。并研究細胞外基質(zhì)基因表達調(diào)控及可能的藥物干預(yù)機制 。 同時檢測多巴胺合成降解關(guān)鍵酶、多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白等，形態(tài)學觀察多巴胺能無長突細胞的改變 、 并研究白化病豚鼠（多巴胺合成障礙）和多巴胺 D2 受體敲除小鼠的屈光發(fā)育過程 、 鞏膜細胞外基質(zhì) 的改變、并 觀察病理性近視時脈絡(luò)膜新生血管 和后鞏膜葡萄腫 的形成過程與自然預(yù)后 病理性近視家系樣本手收集并關(guān)聯(lián)分析，模式動物甲基化譜和表達譜分析 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定與近視相關(guān)的非編碼RNA 建立一個具有足夠樣本并且穩(wěn)定的我國學齡期兒童近視研究隊列，初步搜集影響我國學齡期兒童近視 發(fā)生發(fā)展 的各種環(huán)境因素 建立一系列多巴胺相關(guān)的近視動物模型。 圖 3：課題的立項依據(jù) 四、 實現(xiàn)項目五年預(yù)期目標的總體研究思路和項目研究的技術(shù)路線及可行性。 （ 2）（課題五）研究的視網(wǎng)膜基因表達的改變研究，其結(jié)果可以和視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)的改變及相關(guān)的功能改變（課題二）相關(guān)聯(lián)，（課題五）研究的鞏膜上的基因表達的改變又和鞏膜細胞外基質(zhì)的合成降解機制（課題四）相關(guān)聯(lián)。 研究內(nèi)容： 本課題擬利用病理性近視動物模型，探討病理性近視視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的血管性異常以及鞏膜細胞外基質(zhì)的異常，以探明病理性近視最常見的并發(fā)癥 脈絡(luò)膜新生血管（ CNV）以及后鞏膜葡萄腫的發(fā)病機制，探索視覺信息傳遞的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)通路在鞏膜和視網(wǎng)膜病變之間交流的存在和相互間關(guān)系，以此研究病理性近視并發(fā)癥的發(fā)生機制，同時探討通過信息傳遞的干預(yù)達到延緩或治療并發(fā)癥的可能性。 研究目標： 發(fā)現(xiàn)并鑒定與近視相關(guān)的非編碼 RNA； 闡明 DNA 甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機制對非編碼 RNA 的 調(diào)節(jié)作用； 闡明 近視相關(guān)的非編碼 RNA的功能。 研究目標： 利用基因組學、群體遺傳學和表觀遺傳學的最新策略手段，在全基因組水平上從家系連鎖分析和候選區(qū)域重測序，重癥散發(fā)樣本的外顯子和調(diào)控區(qū)域 重測序，大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)分析和驗證，模式動物的轉(zhuǎn)錄組和甲基化分析以及人眼鞏膜細胞系的遠程調(diào)控元件分析等不同層面，多角度地定位和驗證若干具有代表性的病理性近視易感基因，并發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致發(fā)病的功能性突變或多態(tài)位點。 研究目標： 建立一個 有足夠樣本數(shù)同時穩(wěn)定的學齡期 兒童近視研究隊列，搜集和篩選與我國學齡期兒童近視發(fā)生發(fā)展相關(guān)的各種因素，尤其是關(guān)鍵環(huán)境因素，動態(tài)觀察學齡期兒童近視的發(fā)展規(guī)律，探索近視的發(fā)生及進展的機制。磁共振成像和高分辨腦電、透顱磁刺激、眼動等結(jié)合，和認知科學和心理學行為實驗系統(tǒng)、計算系統(tǒng)配套，形成了一個具備高時間分辨率和高空間分辨率的 中樞分析平臺。涉及的技術(shù)包括免疫組化，激光共聚焦技術(shù)，各種模式膜片鉗，鈣成像，微透析技術(shù)及高效 液相層析分析 ； 應(yīng)用的標本有灌流視網(wǎng)膜鋪片，視網(wǎng)膜薄片，單個分離細胞，培養(yǎng)細胞等，從而有可能對研究主題形成較完整，深入的認識，體現(xiàn)了現(xiàn)代神經(jīng)科學的特點。 二、 創(chuàng)新點和特色 課題的主要創(chuàng)新點和特色包括 以下 6 個方面： 本課題提出視 覺信號處理傳遞和加工異常導(dǎo)致近 視 的關(guān)鍵科學問題，并圍繞此科學問題展開 6 個方向的研究，研究其在近視形成和并發(fā)癥出現(xiàn)上的作用及其機制，從設(shè)計上體現(xiàn)出創(chuàng)新性和特色。 2) 人遺傳性耳聾鼠模型（ Mouse models of human deafness）轉(zhuǎn)基因干預(yù)實驗研究：通過轉(zhuǎn)染正常（野生型）基因，使之在耳蝸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定表達，發(fā)揮基因的正常功能，糾正遺傳缺陷所致耳聾。重點研究耳聾基因?qū)е轮囟雀幸羯窠?jīng)性聾及先天性聾的發(fā)病機制，同時探索致聾基因之間的相互關(guān)系及相互作用。 啟動研究項目，初步匯總各單位生物資源庫，完善建立的出生缺陷平臺資源 第二年 在已經(jīng)收集的遺傳性聾大家系中，運用大家系連鎖定位分析，基因組關(guān)聯(lián)分析，基因功能性克隆等策略發(fā)現(xiàn)新耳聾相關(guān)基因和相關(guān)突變，研究核基因和線 粒體基因組在耳聾發(fā)病過程中所起的作用，研究調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體MPTP 狀態(tài)、凋亡信號途徑及其相應(yīng)的 miRNA 調(diào)控等層面篩選 并發(fā)現(xiàn) 出 35 個感音神經(jīng)性聾易感基因，啟動基因型 表型關(guān)聯(lián)研究； 新耳聾基因功能鑒定； 研究毛細胞損傷機制，獲取 35個關(guān)鍵因子或 miRNA， 發(fā)表 SCI 文章 510 篇，申請專利24 項 系統(tǒng)研究毛細胞損傷的途徑和分子機制； 第三年 完成 我國常見耳聾相關(guān)基因的功能 的研究及 耳聾相關(guān)基因（ GJB 基因突變、大前庭水管綜合癥等）的致聾機制；在調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體MPTP 狀態(tài)、凋亡信號 途徑及其相應(yīng)的 miRNA 調(diào)控等不同層面保護毛細胞免于損傷，重點研究抗凋亡策略保護毛細胞慢性損傷 ，毛細胞再生及干細胞移植實驗。 2. 在理論方面，本項目提出的關(guān)鍵科學問題和科研思路具有科學依據(jù)，代表了世界上感音神經(jīng)性聾發(fā)病機制及干預(yù)措施研究最為前沿和關(guān)鍵的科學問題。 2）同時轉(zhuǎn)染激活前體細胞增殖和促毛細胞分化基因激活毛細胞再生：采用已構(gòu)建的 腺病毒載體，觀察過量表達 Pax2 及 Math1 基因?qū)Τ赡晔蠖佒С旨毎鲋澈头只挠绊?，試圖過量表達 Pax2 激活支持細 胞增殖，同時在增殖細胞中表達 Math1 誘導(dǎo)增殖細胞向毛細胞分化，從而誘導(dǎo)成年鼠耳蝸毛細胞再生。 （ 3） 以線粒體基因組為核心，研究核基因和線粒體基因相互作用的機制及發(fā)現(xiàn)新的基因突變；研究調(diào)控蛋白質(zhì)輸入及抗氧化劑對線粒體缺失大鼠模型耳蝸損傷的保護機制；研究 mtDNA4834bp 缺失模型中相關(guān)氧化磷酸化在耳蝸毛細胞損傷中的作用及其機制； （ 4） 建立 CD 缺失的邊緣細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞系，研究老年性聾相關(guān)基因及抗衰老基因與 CD 的相互作用及機制。 3. 耳蝸毛細胞損傷及保護機制的研究 1）耳蝸損傷機制研究：以毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元線粒體為核心，觀察不同環(huán)境因素作用下毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元死亡形式及相關(guān)信號途徑的活化，研究耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡途徑。 3）研究遺傳性聾規(guī)范化產(chǎn)前診斷技術(shù)：以母體外周血胎兒細胞分離與胎兒 DNA富集為研究重點，開發(fā)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)；結(jié)合產(chǎn)前診斷需求和 高通量基因篩查技術(shù)平臺，研究并初步建立規(guī)范性聾病產(chǎn)前診斷體系，對其模式、效果進行評估。 三、研究方案 1）學術(shù)思路： 本項目圍 繞“毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制、保護措施及功能重建”這個感音神經(jīng)性聾防治的關(guān)鍵科學問題，探索感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及有效的干預(yù)措施，研究重點是揭示重度感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制、病理生理過程及生物學干預(yù)策略?？傮w提高我國在感音神經(jīng)性聾的基礎(chǔ)研究和臨床防治研究的國際競爭力。毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷保護及功能重建：建立安全有效的耳蝸基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，探索保護耳蝸毛細胞免于損傷的抗凋亡等理論與技術(shù)；探索轉(zhuǎn)基因策略修復(fù)基因缺陷所致耳蝸毛細胞損傷的機制；采用聲刺激誘導(dǎo)植入耳蝸的經(jīng)過基因修飾的干細胞定向分化，研究植入干細胞定向分化為毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的分子機制，探索細胞替代策略重建聽覺功能的有效途徑；通過調(diào)控細胞周期 因子激活耳蝸毛細胞再生，鑒定再生毛細胞的功能，為細胞再生途徑重建聽覺功能提供理論依據(jù)。 2）常見耳聾相關(guān)基因致聾機制：應(yīng)用 RNAi 技術(shù)、鋅指核酶技術(shù)、精原細胞注射技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究我國常見耳聾相關(guān)基因（ Connexin 基因、 EVA 相關(guān)基因 SLC26A4 和 Foxi1 等）突變所致耳蝸內(nèi)環(huán)境平衡紊亂的機制及毛細胞功能障礙。 （ 2） 調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)與毛細胞損傷保護，以及抗凋亡基因 XIAP 耳蝸局部轉(zhuǎn)染對耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護作用。 （ 2） 采用膜片鉗技術(shù)結(jié)合 FM143 熒光染色技術(shù)鑒定干細胞源毛細胞的功能。 3) 創(chuàng)新點與特色： 1. 圍繞“毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制、保護措施及功能重建”這個感音神經(jīng)性聾防治的關(guān)鍵科學問題，對我國感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及有效的干預(yù)措施開展具有世界前沿水平的研究； 2. 在研究內(nèi)容和思路上，從核酸 、蛋白、細胞及耳蝸結(jié)構(gòu)等不同層面，針對我國常見感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制展開研究，闡明遺傳因素、環(huán)境因素（噪聲、耳毒性藥物、感染等）和老化因素導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的途徑及其相互作用機制，建立有效的耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元保護措施和探索生物學重建耳蝸功能的途徑。這些前期工作基礎(chǔ)是確保項目順利實施和取得成功的最關(guān)鍵因素。撰寫結(jié)題報告。 3) 老年性聾的發(fā)病機制：以我們建立的大鼠線粒體缺失模型，結(jié)合小鼠核基因突變模型，探討 mtDNA4834bp 缺失模型中相關(guān)氧化磷酸化在毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元老化機制中的作用；探討核基因和線粒體基因常見缺失相互調(diào)控作用，以期發(fā)現(xiàn)老 年性聾新的基因突變；研究蛋白質(zhì)輸入障礙對線粒體突變及對毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷作用。 3) 聲刺激誘導(dǎo)耳蝸移植干細胞