【正文】 全身 單胺能神經(jīng)元 功能障礙與 NMS 發(fā)生的 關系 利用 PD 患者 及健康社區(qū)老年人群 隊列 回顧性病例 對照研究 前瞻性追蹤研究 了解 PD 病人 NMS 的分布及其與關鍵風險基因、環(huán)境暴露、疾病進展和藥物療效反應的關系 NMS 對 PD 早期預警和診斷的 敏感性和特異性 通過對有 NMS 的 老年人群追蹤觀察 PD發(fā)生的風險及其與遺傳和環(huán)境因素交互作用的規(guī)律和特點 動物模型 （ 食蟹猴和轉(zhuǎn)基因鼠） 關鍵基因 探索建立基于 NMS 的 PD 患病風險評估量表 老 化 環(huán)境因素 帕金森病 NMS 研究 基因敲除鼠 /野生鼠 膠質(zhì)細胞 神經(jīng)元共培養(yǎng)體系 NGF/BDNF 等營養(yǎng)因子 ProNGF/ProBDNF 等前體分子 MPTP/MPP+/6 OHDA/LPS/Lactacystin 基因敲除鼠 /野生鼠 膠質(zhì)細胞 神經(jīng)元共培養(yǎng)體系 膠質(zhì)細胞 神經(jīng)元共培養(yǎng)體系 KATP 通道 PHOX/ MMP9 線粒體損傷氧化應激 PP2A/JNK 凋亡 /自噬 存活 凋亡 線粒體 抑制劑 膠質(zhì)細胞 神經(jīng)元 p75Trk p75sortilin 課題 5： 帕金森病 預警、早期診斷與干預的新策略研究 PD 的預警、早期診斷 PD 的干預新策略研究 早期診斷 功能影像學檢測 [18F]AV133 、 99mTcTrodat1及 G964 臨床前研究 研究 臨床大樣本驗證 PD 早期特異性 功能改變 蛋白質(zhì)組學、蛋白芯片篩選新標記物及已有 的 α SYN 、LRRK DJ1 PD（非運動癥狀） 腦脊液、血液 針對 αSYN 蛋白和 5HT 能神經(jīng)元 的探針設計與研究 DA 神經(jīng)元變性死亡 iPS 誘導 增殖 、 擴增 T 褐藻多糖硫酸酯、遠志皂苷、 姜黃素 切割及磷酸化如何調(diào)控GSK3 體外分化成 PD 疾病模型 獲得 PD 治療新靶點新藥物 PD 動物模型 PD 猴模型 GSK3 如何穩(wěn)定 Bim PHOX/MMP9/JNK3 通路變化 DA 能神經(jīng)細胞 行為學變化，腦組織形態(tài)學 變化 為細胞移植治療提供新理論 PD 患者 iPS 誘導 增殖 、 擴增 進一步闡明 PD 發(fā)病機制 PD 發(fā)病機制 /藥物靶點 篩選 研究特色及創(chuàng)新點： 本項目在原 973 項目工作的基礎上，結(jié)合國際 PD 研究的前沿科學問題，以轉(zhuǎn)化醫(yī)學理念為本，充分發(fā)揮我們臨床基礎相結(jié)合的團隊和資源優(yōu)勢，進一步深入研究 PD 發(fā)生發(fā)展機制及防治新策略， 其主要特色和創(chuàng)新點是： 新視角： 從臨床實際出發(fā)，將 PD 視為 “由運動和非運動癥狀組成的一 種全身性疾病 ”；系統(tǒng)研究非運動癥狀與運動癥狀的相互關系及其產(chǎn)生機制，不僅有助于更加全面的認識 PD 發(fā)病機制，還可以為 PD 的早期診斷和系統(tǒng)治療提供理論依據(jù)。 在早期診斷和干預策略領域研究中： （ 1）已設計合成了靶向 DAT 及 VMAT2 的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新化合物， 并已基本完成臨床前研究，具有良好應用前景；（ 2）已發(fā)現(xiàn)多種具有抗 PD 作用的候選藥物和若干潛在的藥物作用靶點；（ 3） 已建立了誘導 iPS 細胞的慢病毒體系及體內(nèi)外誘導神經(jīng)干細胞向 DA 能神經(jīng)元分化的方法體系。 2. 純化 Hsp22 Tg 與 knockout 小鼠；研究 DA 受體對 DA 神經(jīng)元變性的作用； PD 相關蛋白表達載體構(gòu)建； Knockdown 實驗研究 Omi、Parkin 和 PINK 對線粒體復合物 I活性的影響和抑制作用 ； 觀察激活的 PKC 亞型，以及 PKC 激活引起的 IRPs 的磷酸化水平，并在IRP1/IRP2 基因敲除的動物上進一步證實上述研究內(nèi)容。 研究內(nèi)容 預期目標 抑制劑的治療作用；在 PD 模型中觀察中藥療效； 完善 iPS 細胞的誘導、增殖、向神經(jīng)干細胞分化、神經(jīng)干細胞分選和體外擴增的方法體系 。 5. 顯像探針的臨床前藥理藥效學研究；建立新探針的生物評價方法與篩選方法；評價 calpain 切割GSK3β這一事件在 PD 發(fā)生中的作用； 體外建立神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系，觀察藥物對神經(jīng)元的營養(yǎng)、對小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活的作用 ；定向誘導 iPS細胞定向分化為 DA 能神經(jīng)元。 1. 初步完成對選定社區(qū)人群易感基因和環(huán)境危險因素暴露的調(diào)查情況，掌握易感或高危人群；爭取發(fā)現(xiàn) 12個與 PD相關的風險基因或多態(tài)性；證明環(huán)境毒素如何在衰老基礎上加重 PD 致病基因編碼蛋白的修飾和對線粒體功能的影響與機制。 2. 力爭在 vav 研究中取得成果發(fā)表論文；闡述翻譯后修飾對 PD 相關蛋白的功能影響以及其在疾病發(fā)生中的作用；初步獲得具有保護作用的化合物；膠質(zhì)細胞通過iNOS 的激活參與神經(jīng)元鐵代謝。 3. 研究 MPP+/LPS 對 各種混合 培養(yǎng)體系中 DA 能神經(jīng)元損傷的影響及其機制；長時程實時觀察經(jīng)元網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用；體外建立PHOX/MMP9 基因敲除鼠黑質(zhì)神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系，觀察MPP+/6OHDA/LPS 對神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的影響 ， 分析相關信號轉(zhuǎn)導通路；應用生物信息學、蛋白功能域分析鑒定和單克隆抗體封閉等技術(shù)，1. 對社區(qū)人群中存在危險遺傳基因和環(huán)境暴露個體進行檢查和確診；發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護劑保護 DA 神經(jīng)元的潛在靶點。 6. 對本課題的實驗結(jié)果進行系統(tǒng)總結(jié)整理，進行項目的總結(jié)和 成果鑒定。 探討黑質(zhì)特異表達的蛋白質(zhì)異常與金屬離子選擇性聚集以及線粒體功能障礙等環(huán)節(jié) 相互 作用 在 DA 能 神經(jīng)元選擇性變性死亡中的作用；闡明神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞 網(wǎng)絡 功能失衡在神經(jīng)元選擇性 、進行 性變性 死亡 中的作用機制。 五年預期目標： 發(fā)現(xiàn)一批新的組蛋白修飾因子 ， 探明 組蛋白修飾與 DNA 甲基化之間相互作用的分子機制， 篩選一批 腫瘤相關 ncRNA，鑒定一批具有潛在臨床應用價值的腫瘤診斷及治療的新的 ncRNA 分子靶標；鑒定一批新的 EMT 關鍵調(diào)控因子 ；發(fā)現(xiàn)針對轉(zhuǎn)移型乳腺癌、肺癌的新的有效治療靶點。篩選出影響 DNA 甲基化酶和 DNA 結(jié) 合的關鍵性因子或蛋白；明確相關關鍵性因子 或 蛋白與 DNA 甲基化酶及 DNA 結(jié)合蛋白作用的分子機制，進一步明確特定基因發(fā)生 DNA 甲基化的分子機制，進而揭示組蛋白修飾 與 DNA 甲基化 相互作用 的分子機制。在此基礎上，利用動物模型和臨床標本對組蛋白修飾候選因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用做深入分析。在此基礎上，對差異表達的新基因及特異性組蛋白修飾酶在 EMT 以及在乳腺癌轉(zhuǎn)移及藥物耐受中的作用做深入分析。 具體方案如下： 課題 負責人： 劉芝華，中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所 學術(shù)骨干： 李曉濤，華東師范大學生命科學研究所 曲春楓，中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所 課題六：惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡 利用腫瘤基因表達和表觀遺傳學數(shù)據(jù)，采用計算生物學方法推測在惡性腫瘤、干細胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學調(diào)控網(wǎng)絡。通過干擾預測的上游調(diào)控節(jié)點后以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù)對下游節(jié)點進行檢測，對以上預測模型中的關鍵調(diào)控關系進行驗證。 圖 2： 如何通過干擾上游調(diào)控節(jié)點并以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù) 檢測下游基因驗證預測模型中的關鍵調(diào)控關系 具體方案 如下： 課題 負責人：韓敬東，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 學術(shù)骨干： 吳 旻 ，武漢大學生命科學學院 染色質(zhì)與組蛋白的多種表觀遺傳學修飾 關鍵轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控關系 轉(zhuǎn)錄因子的 ChIPseq實驗 基因表達譜差異分析 染色質(zhì)構(gòu)型分析 表觀遺傳因子 ChIPseq實驗 絕緣子的基因組分布 表觀遺傳因子的基因組分布 轉(zhuǎn)錄因子的目標基因分布 染色質(zhì)空間形態(tài)與 DNA、組蛋白修飾的因果調(diào)控網(wǎng)絡 關鍵轉(zhuǎn)錄因子與目標基因的 調(diào)控網(wǎng)絡 多 因 素 SNP 與GWAS分析：鑒定腫瘤發(fā)病相關的重要基因突變相互關系 惡性腫瘤發(fā)病因素預測的因果網(wǎng)絡模型 RNAi 與基因 敲除研究：驗證腫瘤發(fā)病相關轉(zhuǎn)錄因子與基因的影響范圍 惡性腫瘤高通量數(shù)據(jù)的整合與網(wǎng)絡的計算預測 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預期目標 第 一 年 1） 多種手段研究肺癌細胞腫瘤抑制基因甲基化狀況，開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關 DNA 甲基化標志物研究；開展 PcG 蛋白表達變異與腫瘤抑制基因表觀遺傳失活關系研究； 2） 利用高通量芯片、 ChIPChip、ChIPseq、酵母雙雜交、免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，針對 TGFβ和雌激素信號通路相關因子，如轉(zhuǎn)錄因子 Smad ER 及其轉(zhuǎn)錄輔助因子，篩選新的組 蛋白修飾基因或 miRNA； 3） 利用 RNASELEXseq 等技術(shù)平臺系統(tǒng)篩選鑒定與腫瘤相關蛋白相互作用的 ncRNA；檢測 ncRNA 的表達譜； 4） 誘導或抑制 EMT 表型。 5） 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微環(huán)境中的成纖維細胞 、 浸潤巨噬 細胞 、 浸潤的單核巨噬細胞 ，分析 miRNA及 mRNA的表達譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌中上皮細胞與間質(zhì)細胞的表達譜差異 ； 6） 開發(fā)能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。這樣 就可以人為 地 提高或降低上游事件的水平，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達，或者組蛋白或 DNA 修飾的水平的變化，來證實我們所預測的因果關系。 （ 1） 考慮到實驗方法與手段的多樣性，需要開發(fā)能夠自動整合 并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。用基因表達譜、蛋白質(zhì)譜及全蛋白磷酸化譜分析在三種條件下共同變化的靶基因及蛋白分子。本課題將以乳腺癌細胞系、腫瘤組織、腫瘤啟動細胞為模型，利用自主建立的 RNASELEXseq 技術(shù)平臺系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)和鑒定與腫瘤相關蛋白（特別是其中的轉(zhuǎn)錄因子和表觀修飾酶）發(fā)生相互作用的 ncRNA；還將采用不同大小的 ncRNA的 cDNA 文庫（ sizefractioned RNA library）鑒定腫瘤啟動 細胞特異的 ncRNA。本研究還將以多種器官的正常組織和腫瘤組織為對象，了解正常組織細胞中 PcG 蛋白的正常組合關系，研究這種正常組合關系破壞與腫瘤發(fā)生的關系及其 與 腫瘤相關基因組蛋白修飾、核小體定位和 DNA 甲基化發(fā)生的關系 。 培養(yǎng)一批中青年學術(shù)帶頭人和 學術(shù) 骨干；培養(yǎng)研究生 （含碩、博） 50 名以上 、博士后 12 名以上 。 利用我們現(xiàn)有的 PD 臨床 數(shù)據(jù)庫、 標本庫 及健康社區(qū)老年人群隊列及標本 庫，開展回顧性 /前瞻性隊列研究，探討 NMS 在 PD 的發(fā)生率、與臨床病程的相關性；利用動物模型探討 αSYN 隨齡表達增加與環(huán)境、遺傳因素相互作用 導致相關神經(jīng)元功能障礙和 NMS 的機制，為確立 PD 預警和干預的新靶標提供科學依據(jù)。 在前期工作 基礎上，結(jié)合目前國際學術(shù)前沿，從啟動因素、關鍵環(huán)節(jié)和漸進性加重機制三個層面，探討老化、遺傳和環(huán)境因素相互作用啟動 DA 能 神經(jīng)元變性死亡的機制；認識黑質(zhì)特異性表達的蛋白質(zhì)以及金屬離子異常聚集、線粒體功能障礙等關鍵環(huán)節(jié)在神經(jīng)元選擇性變性死亡中所起的作用；闡明神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞網(wǎng)絡功能失 衡 最終導致神經(jīng)元變性死亡進行性加重的過程及其機制；關注嚴重影響患者生活 質(zhì)量的 NMS 并開展機制研究；建立基于遺傳學、生物化學、 臨床癥狀學、 影像學等為基礎的早期預警和診斷的指標體系；深入研究具有自主知識產(chǎn)權(quán)或前期工作基礎的具有神經(jīng)保護作用的先導化合物或候選靶標，積極開展靈長類 iPS 細胞 移植治療 PD 的相關研究。 3. 闡明 胞 神經(jīng)元相互作用的調(diào)節(jié)及其在 DA 能神經(jīng)元損傷中的作用；進一步證實 PHOX/MMP9 在小膠質(zhì)細胞介導的免疫炎癥和氧化應激以及 DA 能神經(jīng)元損傷中的作用，為其作為神經(jīng)保護作用靶點提供依據(jù)；深入闡明 p75Trk、p75sortilin 分子間相互作用的功能結(jié)構(gòu)區(qū)、及其藥物干預與生物效應的新靶位意義 ； 明確誘導活化的膠質(zhì)細胞反作用于神經(jīng)元對PINK1 和 α Syn 基因基因異常表達的影響及自噬、凋亡的發(fā)生 。 4. 闡明α Syn 基因與環(huán)境毒素的相互作用對黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷及 NMS 的作用機制；初步描繪αSYN 與環(huán)境毒素機制線