【正文】 可視化成像，闡明關(guān)鍵信號蛋白相互調(diào)控的 分子 機制。本課題將制備基因干預動物模型，結(jié)合分子生物 /生物化學、電生理及成像技術(shù)等現(xiàn)代技術(shù)，深入研究細胞多信號的相互調(diào)控，并闡明其整合機制 .主要研究內(nèi)容有：可遺傳熒光分子探針動物模型；鈣信號與 ROS 信號的交互調(diào)控；關(guān)鍵信號蛋白的遺傳干預。本課題通過圍繞細胞鈣 信號、線粒體 ROS 信號及相關(guān)關(guān)鍵信號蛋白構(gòu)成的信號體系，以生物物理原理和統(tǒng)計、數(shù)學理論為基礎，以理論分析、數(shù)值模擬和針對性的實驗設計與驗證為方法，通過對不同時空尺度變化的時空動態(tài)數(shù)據(jù)的分析建立理論模型，從控制和優(yōu)化的角度研究系統(tǒng)的性質(zhì)。通過利用大規(guī)模 RNA 干擾篩選技術(shù)，篩選和確定在這些信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵分子，利用共聚焦顯微鏡、 CARS、 SRS 等高分辨三維成像技術(shù)， 進行時空動態(tài)示蹤，詳細闡釋關(guān)鍵分子的作用機制，在光學顯微觀察技術(shù)上，引入相干拉曼散射作為成像的新模態(tài)，可以擺脫標記的困難，在顯微圖像的分析上，引入新的圖像處理方法，提高可靠性。課題三密切配合課題一、二，研究關(guān)鍵信號蛋白的分子動態(tài)和相互作用。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預期目標 第 一 年 1. 建立小鼠鈣信號異常病理模型，研究細胞鈣振蕩和螺旋波的時空動態(tài)。 5. 建立分子寡聚體系相互作用的米氏方程組；發(fā)展針對時空動態(tài)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析與建模工具；研究細胞信號動態(tài)的數(shù)學模型，與實驗數(shù)據(jù)進行比較，針對性的實驗設計與驗證。 3. 發(fā)展光激活熒光蛋白等特異標記技術(shù)；建立在大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞具有普適性的熒光蛋白標記方法，發(fā)展新的活體標記平臺； 建立并完善 SRET技術(shù) ，實現(xiàn)多個蛋白相互作用的檢測。確定適合大規(guī)模細胞的種類、 ROS 信號檢測或示蹤探針以及 siRNA 轉(zhuǎn)染的參數(shù)等；建立不少于 500 條 siRNA 的文庫；完成 CARS 顯微鏡的建設，獲取穩(wěn)定的 CARS 信號，實現(xiàn)對脂類分子和亞細胞脂肪顆粒的實時觀察。 3. 應用非天然氨基酸標記、 Sortase標記技術(shù)，對磷酸二酯酶高特異性標記；對 AdR 募集磷酸二酯酶寡聚復合體進行可視化研究。 1. 闡明鈣釋放通道分子性質(zhì)與鈣火花及其自組織時空動力學的關(guān)系、以及 CPVT 分子病理機制；闡明 ROS 信號對細胞 胞漿鈣振蕩發(fā)生及 其振蕩模式的影響，闡述 ROS 單線態(tài)氧分子對細胞表面 G 蛋白耦聯(lián)受體所介導的信號通路（鈣振蕩通路）的調(diào)控 。 5. 分子寡聚體系米氏模型理論；刻畫米氏模型介觀穩(wěn)定性的控制和優(yōu)化參數(shù)；改進的細胞信號動態(tài)數(shù)學模型以及進一步的實驗設計與驗證。 3. 應用小分子探針標記，標記鈣離子信號和 ROS 信號分子；將鈣離子探針與線粒體蛋白特異結(jié)合，對線粒體 ROS 與鈣相互作用進行實時動態(tài)研究 。 1. 闡明胞膜窖中 G 蛋白、鈣信號蛋白、激酶、磷酸二酯酶空間募集與局部信號控制的關(guān)系；闡明細胞主要表達的 TRP 通道，及核定位的 TRP 通道。 4. 闡明細胞多信號體系相互調(diào)控鈣、 ROS 信號的分子機制，為相關(guān)疾病的防治提供理論基礎。研究攝鈣蛋白攝鈣功能的變化，與蛋白氧化修飾的關(guān)系 。 5. 進一步結(jié)合實驗研究分子寡聚體系介觀穩(wěn)健性行為；從實際數(shù)據(jù)反演細胞信號動態(tài)的數(shù)學模型的參數(shù)和分布函數(shù)。 3. 設計核酸模板控制下的雙探針系統(tǒng)，并通過化學方法，靈活的改變其化學結(jié)構(gòu)，獲得多元化的探針；闡述細胞凋亡過程中 ROS 和鈣信號的協(xié)同失穩(wěn)態(tài)的正反饋過程。 研究內(nèi)容 預期目標 第 五 年 1. 研究心衰等疾病條件下鈣小星觸發(fā)鈣火花 過程中鈣釋放通道的時空募集過程，分析其動力學的差異；研究單線態(tài)氧分子對溶酶體鈣離子通道的調(diào)節(jié)，所導致的胞漿鈣振蕩變化；研究氧化型通道蛋白結(jié)構(gòu)的何種變化，導致了溶酶體鈣通道功能的改變。 5. 結(jié)合細胞鈣信號、線粒體 ROS 信號及相關(guān)關(guān)鍵信號蛋白構(gòu)成的信號體系，完善描述分子寡聚體系多尺度時空動態(tài)隨機模型；完善基于數(shù)據(jù)驅(qū)動的細胞信號動態(tài)數(shù)學模型的研究工作。 2. 發(fā)現(xiàn)新的超氧炫關(guān)鍵調(diào)控蛋白，并闡明新的超氧炫信號調(diào)控機制 。 6. 在動物模型上完成相關(guān)機理的研究實驗；實現(xiàn)在模式動物上的視頻幀率（大于 25 幀 /秒）的高分辨動態(tài) SRS 顯微觀察；建立適于活細胞內(nèi)熒光實時動態(tài)觀測的數(shù)據(jù)分析和圖像處理方法。然而，細胞信號系統(tǒng)作為一個整體，其行為具有極強的確定性。 關(guān)鍵科學問題： 本項目擬以我們過去的研究基礎和多學科優(yōu)勢為基礎，以細胞鈣信號、線粒體 ROS 信號及相關(guān)關(guān)鍵信號蛋白構(gòu)成的信號體系為 突破口，解決這樣 一個關(guān)鍵科學問題：細胞信號的微觀隨機動態(tài)如何實現(xiàn)細胞調(diào)控的系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。我們發(fā)現(xiàn) ， LCCRyR 間的 CICR 效率較高，但 RyR 與 RyR 之間在正常生理條件下卻幾乎不能耦聯(lián)。但我們最近在一種兒茶酚胺敏感的室性心動過速（ CPVT）的小鼠模型中，觀察到激動 ?腎上腺素受體 （ AdR）會在細胞中產(chǎn)生持續(xù)旋轉(zhuǎn)的螺旋波，我們認為這是 CPVT 發(fā)生致死性心律失常的關(guān)鍵微觀事件。 許多病理條件下，線粒體代謝模式發(fā)生顯著變化。例如，我們發(fā)現(xiàn)鈣信號會激活 ROS， ROS 也會導致細胞內(nèi)鈣濃度升高，二者在 ?AdR 激動下發(fā)生正反饋，導致細胞凋亡。 4. 信號 分子微觀 隨機 性與細胞信號系統(tǒng) 穩(wěn)健性 的關(guān)系 各種細胞信號系統(tǒng)構(gòu)成了一個相互作用的復雜 系統(tǒng)。通過對 時空動態(tài)成像數(shù)據(jù)的降維 與模型結(jié)合，實現(xiàn)模型參量估計；通過模型仿真，預測系統(tǒng)性質(zhì)并提交實驗驗證；通過考察模型內(nèi)在關(guān)系，提出新理論，闡明 信號分子微觀隨機性與細胞信號系統(tǒng)穩(wěn)健性的關(guān) 系 。這些關(guān)鍵技術(shù)不僅將為本項目提供有力支撐，同時也將產(chǎn)生具有自主知識產(chǎn)權(quán)、推動相關(guān)領域發(fā)展的技術(shù)創(chuàng)新 。除利用市場現(xiàn)有產(chǎn)品外，我們將充分發(fā)揮項目組成員在新型成像技術(shù)方面的技術(shù)優(yōu)勢，發(fā)展 CARS/SRS 顯微技術(shù) ， 解決部分 不易標記的 信號分子動態(tài)可視化問題； 利用 STED 高分辨 技術(shù) 研究信號蛋白的空間定位和位移， 利用可視化技術(shù)從事 RNA 干擾 的通量化篩選。我們在以上實驗研究中產(chǎn)生了大量關(guān)于鈣信號、 ROS 信號及 AdR 信號系統(tǒng)調(diào)控的定量數(shù)據(jù)。同時，我們將運用 基因 敲除 、基因 突變、基因沉默 等技術(shù)，通過對 關(guān)鍵 信號 分子 進行遺傳干預，研究 鈣信號系統(tǒng)、線粒體 ROS 信號系統(tǒng)與 AdR 信號系統(tǒng)之間交互調(diào)控關(guān)系，闡明三者間相互協(xié)調(diào)、維持細胞信號穩(wěn)態(tài)的機制。因此，我們將研究 AdR 信號轉(zhuǎn)導對超氧炫頻率和動力學性質(zhì)的影響，并找出這種影響的信號通路，闡明線粒體 ROS 信號失穩(wěn)態(tài)機制。 2. 線粒體 ROS 信號超氧炫及調(diào)控 超氧炫是利用我們 最新發(fā)明 的 超氧陰離子熒光蛋白探針 cpYFP 觀察到的線粒體 ROS 爆發(fā)。 在某些病理條件， RyR 與 RyR 之間也可以發(fā)生 CICR，這便形成鈣波。 主要研究內(nèi)容： 1. 胞內(nèi)鈣信號時空動態(tài)及調(diào)控 鈣小星觸發(fā)鈣火花的鈣致鈣釋放（ CICR）是細胞產(chǎn)生和放大細胞鈣信號的基本過程。這種細胞和機體機能的穩(wěn)定性在生理學上叫做穩(wěn)態(tài)，在控制理論上稱為魯棒性或穩(wěn)健性 （ robustness）?？梢暬芯糠椒ǖ膬?yōu)勢是“ 看”到了細胞信號的微觀隨機過程。 4. 在整體動物上驗證細胞多信號失調(diào)及鈣信號紊亂與相關(guān)疾病的關(guān)系及機制，并為發(fā)展防治相關(guān)疾病的藥物創(chuàng)新提供理論基礎。 1. 闡釋細胞納米尺度局部控制的病理變化機制，尋找防治疾病條件下細胞鈣信號失穩(wěn)態(tài)的策略；闡明 ROS 單線態(tài)氧分子對溶酶體鈣通道的調(diào)節(jié)，所導致的胞漿鈣振蕩變化。 3. 進一步優(yōu)化可視化研究的分析；結(jié)合課題一、二取得的進展，深入闡明信號通路關(guān)鍵蛋白與鈣信號和 ROS 信號系統(tǒng)的相互調(diào)控。 5. 針對細胞鈣信號、 ROS 信號及相關(guān)信號蛋白構(gòu)成的信號體系，提出信號 分子寡聚體系的介觀穩(wěn)健性原理 。 1. 闡釋細胞鈣致鈣釋放納米尺度局部控制的分子和動力學機制，以及這種控制對細胞鈣穩(wěn)態(tài)的重要意義；闡明 ROS 單線態(tài)氧分子對細胞線粒體攝鈣蛋白的特異性調(diào)節(jié)，及其所導致的胞漿鈣振蕩變化 。 3. 應用多元化的核酸模板控制下的雙探針 系統(tǒng)，通過可視化研究，分析信號通路關(guān)鍵蛋白復合體在細胞內(nèi)形成和分解過程；利用該探 針 技 術(shù) 研 究 ROS 激活caspase 和鈣依賴性蛋白激酶的過程。 6. 初步掌握兩到三個基因體外和細胞的作用機制證據(jù)；初步實現(xiàn)細胞的顯微鏡下實時動態(tài) 培養(yǎng)和CARS/SRS 的實時動態(tài)觀測；建立共聚焦熒光成像系統(tǒng)的點擴散函數(shù)模型，實現(xiàn)反卷積方法，提高圖像分辨率。 2. 超氧炫信號特 性在代謝疾病中發(fā)生明顯改變，有可能作為 診斷、治療代謝疾病的靶點； 超氧炫信號特性在神經(jīng)性疾病中發(fā)生明顯改變，有可能作為 診斷、治療神經(jīng)性疾病的靶點。 5. 改進分子寡聚體系米氏模型， 刻畫其亞穩(wěn)態(tài)行為；基于相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，發(fā)展時空動態(tài)數(shù)據(jù)提取的分析與建模方法；針對細胞信號動態(tài)的數(shù)學模型，研究模型參數(shù)和分布函數(shù)的反演方法。 研究內(nèi)容 預期目標 第 三 年 1. 以 ?2 腎 上 腺 素 受體 介 導 的cAMPPKA 為例，研究 G 蛋白耦聯(lián)受體局部調(diào)節(jié)細胞鈣信號的分子機制；研究細胞主要表達的TRP 通道類型及亞細胞定位；研究 ROS 單線態(tài)氧分子對細胞Ca2+ATPase 功能的調(diào)節(jié)，及所導 致的 Ca2+ATPase 氧化修飾 。 3. 發(fā)展各類小分子標記技術(shù)；揭示AdR 局部信號轉(zhuǎn)導的分子機制。 5. 對分子寡聚體系米氏模型進行數(shù)值模擬和理論分析；基于數(shù)值模擬和實驗數(shù)據(jù) , 發(fā)展從時空動態(tài)數(shù)據(jù)提取 穩(wěn)健行為的分析與建模方法；改進細胞信號動態(tài)的數(shù)學模型，并與實驗數(shù)據(jù)進行比較，針對性的實驗設計與驗證。研究 ROS 單線態(tài)氧分子對細胞表面 G 蛋白耦聯(lián)受體介導的鈣信號 的調(diào)控作用 。 5. 分子寡聚體系米氏模型；從時空動態(tài)數(shù)據(jù)提取某些低維流形和穩(wěn)健行為表示；細胞鈣信號動態(tài)的數(shù)學 模型、初步的實驗設計與驗證。 1. 闡明 細胞鈣信號自組織過程及其生理和病理意義。 3. 構(gòu)建光激活熒光蛋白與鈣致鈣釋放蛋白復合體中有關(guān)信號蛋白的融合載體； 通過對分子聚集的時空動態(tài)的可視化研究，分析鈣致鈣釋放蛋白復合體 與 RyR 的關(guān)系。 課題四、五在上述分析的基礎上，分別以遺傳干預等實驗手段、建模仿真等理論手段，研究課題一、二、三中信號動態(tài)相互調(diào)控的穩(wěn)態(tài)整合，重點揭示微觀隨機信號形成系統(tǒng) 穩(wěn)健性的基本原理，在實驗研究的基礎上產(chǎn)生理論升華。 承擔單位： 北京大學 課題 組長 ： 席建忠 學術(shù)骨干： 謝曉亮、黃巖誼、熊春陽 經(jīng)費 比例： 22% 5. 課題間的關(guān)系 各課題 圍繞 細胞信號 動態(tài)這一 國際前沿科學問題 ， 在 研究過程中緊密配合、優(yōu)勢互補，資源共享。本課題基于項目組深入的研究工作和新穎的高分辨、高通量時空動態(tài)成像技術(shù)，提出了具有創(chuàng) 新性的研究方案，有關(guān)研究對于深入認識生物功能多樣性和穩(wěn)定性具有重要意義。 承擔單位： 中國科學院生物物理研究所、中南民族大學 課題 組長 ： 姬 廣 聚 學術(shù)骨干： 劉慶華、苗林、馮涓涓 經(jīng)費比例： 14% 課題 5 信號分子時空隨機性與介觀行為穩(wěn)健性 研究內(nèi)容 ： 生命科學正在進入分子和細胞水平的定量研究，探索分子和細胞行為的理論模型具有重要意義。 承擔單位： 中國科學院植物研究所、北京大學 課題 組長 ： 林金星 學術(shù)骨干： 何川、李笑宇 經(jīng)費比例： 18% 課題 4 細胞多信號體系的整合調(diào)控 研究內(nèi)容 ： 細胞生命活動功能受到眾多信號分子的調(diào)控，如 RyR、 IP3R等鈣通透性膜通道、 AdR 等受體及 、 Yap、 ROS、 DJ1 等調(diào)節(jié)蛋白。 研究 目標： 以超氧炫信號為基礎，在整體動物水平實時監(jiān)測正常生理代謝過程及有關(guān)病理過程中 ROS 信號的變化及其作用機制，探討超氧炫信號用于診斷的可行性。 承擔單位： 北京大學、北京師范大學 課題組長： 王世強 學術(shù)骨干： 崔宗杰 經(jīng)費比例： 20% 課題 2 超氧炫與細胞 ROS 信號時空動態(tài) 研究 內(nèi)容 ： ROS 信號與細胞信號通路調(diào)節(jié)、應激反應、衰老、凋亡以及多種疾病密切相關(guān)，