【正文】 5. 細胞動態(tài)研究關(guān)鍵 成像 技術(shù) 我們在以上前沿探索中，將對新模態(tài)、高分辨、高通量成像研究技術(shù)產(chǎn)生迫切需求。因此，本項目將研究調(diào)控 鈣和 ROS 信號 的關(guān)鍵蛋白在 AdR 激動下的募集、轉(zhuǎn)位和寡聚化的時空 動態(tài)，闡明這些信號蛋白間不同的時空動態(tài)相互作用如何決定 鈣 信號 和 ROS 信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性修飾，有重點地揭示關(guān)鍵蛋白行為異常與細胞鈣信號、 ROS 信號失穩(wěn)態(tài)的關(guān)系。因此我們將研 究 RyR 之間通過 CICR 產(chǎn)生螺旋波的時空動態(tài)機制，揭示兒茶酚胺如何通過 AdR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致螺旋波發(fā)生，造成胞內(nèi)鈣信號失穩(wěn)態(tài)。 這個關(guān)鍵問題可按層次分為三個子問題： 1． 鈣信號、 ROS 信號各自的微觀隨機動態(tài)與自身穩(wěn)態(tài)； 2． 關(guān)聯(lián)鈣信號、 ROS 信號的關(guān)鍵信號蛋白的行為動態(tài)； 3． 多信號系統(tǒng)如何通過信號蛋白交互作用實現(xiàn)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。 一、研究內(nèi)容 研究細胞信號時空動態(tài)的根本目的并不在于信號的時空特征本身，而是通過對時空特征的了解，闡述生命活動的基本機制 。 6. 在動物模型驗證分子機理；利用SRS 顯微鏡進行模式動物的高分辨快速動態(tài)過程的觀察；在前期實驗的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化共聚焦熒光圖像處理算法。 4. 闡明 、 junctin、 yap、DJ CALHM1~2 在調(diào)控鈣信號和 ROS 信號協(xié)同穩(wěn)態(tài)中的作用及分子機制，并闡明這信號蛋白調(diào)控異常與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 2. 利用高通量 RNA 干擾技術(shù)和生物信息學(xué)手段，通過在整個基因組水平干擾基因的表達，尋找超氧炫信號的調(diào)控分子，并建立調(diào)控超氧炫信號的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。了解 ROS 單線 態(tài) 氧 分 子 對 細 胞Ca2+ATPase 的氧化修飾調(diào)節(jié) 。 6. 找到 三到五個新的 ROS 代謝調(diào)控因子，并利 用 Northern、Western 等方法進行驗證；對相干拉曼光譜的激發(fā)光進行調(diào)制，實現(xiàn)受激拉曼散射，完成 SRS顯微鏡的建設(shè)，并利用 SRS 顯微鏡對脂類分子和亞細胞脂肪顆粒實現(xiàn)非標(biāo)記實時定量圖像檢測；實現(xiàn)噪聲背景下共聚焦目標(biāo)熒光圖像的快速識別、匹配。 4. 在基因編碼熒光蛋白平滑肌和線粒體特異表達的小鼠模型上分析鈣信號和超氧炫的時空特性及在高血壓過程中的變化規(guī)律。 4. 成功獲取 23 個與調(diào)控細胞鈣信號相關(guān)蛋白的遺傳干預(yù)小鼠動物模型和可遺傳分子探針的動物模型。 2. 建立不同組織特異性表達超氧陰離子熒光蛋白探針 cpYFP 的轉(zhuǎn)基因小鼠，和在體實時、原位監(jiān)測超氧炫信號的技術(shù)平臺。 研究目標(biāo)： 通過和項目中其他課題的密切合作，開發(fā)和發(fā)展新的研究手段和方法，重點提供以高通量可視化的蛋白基因篩選、關(guān)鍵信號分子的非標(biāo)記三維顯微成像、熒光動態(tài)信號的圖像處理為基礎(chǔ)的新方法， 為整個項目提供技術(shù)支撐，同時產(chǎn)生具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的細胞信號研究新技術(shù) 。 研究 目標(biāo)： 闡明 、 junctin、 yap、 DJ CALHM1~2 在調(diào)控鈣信號和 ROS 信號協(xié)同穩(wěn)態(tài)中的作用及分子機制，并闡明這信號蛋白調(diào)控異常與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；揭示心肌和血管平滑肌細胞鈣信號、 ROS 信號與相關(guān)關(guān)鍵 信號蛋白間的整合調(diào)控關(guān)系；在整體動物上驗證細胞多信號失調(diào)及鈣信號紊亂與相關(guān)疾病的關(guān)系，并為發(fā)展防治相關(guān)疾病的藥物創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)。本研究將在此研究成果基礎(chǔ)上，進一步發(fā)展在體實時探測 ROS 技術(shù)，并結(jié)合代謝模式轉(zhuǎn)變的疾病動物模型，深入探討 ROS 信號時空特性及其分子調(diào)控機制，從新的視野研究 ROS 信號的病理生理意義。 本項目的主要研究骨干來自 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、工學(xué)院、化學(xué)學(xué)院、數(shù)學(xué)學(xué)院，中科院生物物理所 ， 中科院植物所，北京師范大學(xué) 和中南民族大學(xué) ，匯聚 了 來自細胞生物學(xué)、生物物理學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué) 、 化學(xué)、光學(xué)、數(shù)學(xué)、工學(xué)等 多學(xué)科 的專家 ，聯(lián)合組成跨學(xué)科攻關(guān)團隊 。深入研究這一動態(tài) 體系 中 細胞信號的相互作用 規(guī)律需要整合不同學(xué)科的優(yōu)勢 。更為重要的是，本項目成員多年來保持密切交流和合作，不 僅多次召開學(xué)術(shù)研討會，還產(chǎn)生了多項重要合作研究成果。 雖然系統(tǒng)的維數(shù)很大， 但是 通常只有幾個 反應(yīng)是限速的 (ratelimiting)。 我們還將 設(shè)計具有特殊光學(xué)性質(zhì)的熒光蛋白 、 pHluorin與信號蛋白 的 表達 體系 ，進行穩(wěn)定遺傳 。 2. 技術(shù)路線及可行性： 本項目將采取 多學(xué)科相互交叉、滲透和有機結(jié)合的途徑，重點圍 繞鈣信號和 ROS信號時空動態(tài) 關(guān)系，研究關(guān)鍵 信號蛋白 如何 相互作用實現(xiàn)穩(wěn)態(tài)這一關(guān)鍵科學(xué)問題，結(jié)合分子探針、顯微成像關(guān)鍵技術(shù)的完善與發(fā)展，系統(tǒng)地開展跨學(xué)科的基礎(chǔ)研究。從而造就 一批在細胞信號時空動態(tài)研究領(lǐng)域有國際競爭力的優(yōu)秀中青年科學(xué)家和后備人才， 建設(shè) 一支結(jié)構(gòu)合理、具備攻堅能力的國際水平研究隊伍； 6． 主辦 1～ 2 次細胞信號 動態(tài)國際學(xué)術(shù)會議，強化我國在該領(lǐng)域的國際學(xué)術(shù)地位； 7. 研究成果主要以研究論文和獨立開發(fā)的技術(shù)成果（專利）形式公布，五年內(nèi)爭取發(fā)表 SCI 論文 100 篇，其中 相關(guān)領(lǐng)域主流學(xué)術(shù)期刊不少于 40%，力爭在Cell、 Nature 或 Science 上發(fā)表論文，并申報專利 10 項 。 課題五 神經(jīng)環(huán)路異常的分子機制 突觸與神經(jīng)環(huán)路功能失常 是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要特征。 主要研究內(nèi)容 ： 1. 在神經(jīng)元極性建立中細胞骨架的調(diào)節(jié)機制和膜組分的不對稱轉(zhuǎn)運機制； 2. 神經(jīng)元電活動調(diào)節(jié)樹突發(fā)育及突觸功能的分子機制； 3. 樹突和突觸修剪的調(diào)節(jié)機制。 一、研究內(nèi)容 圍繞神經(jīng)環(huán)路的形成、功能與可塑性這一主題，所建議的 五 個研究課題將用各種實驗手段力爭在神經(jīng)環(huán)路的形成過程、信息編碼和處理的功能、及神經(jīng)環(huán)路的可塑性等方面取得重要突破。建立猴的光遺傳手段和電 生理記錄手段 ； 8. 了解蘑菇體神經(jīng)元與其他侵入蘑菇體小葉的神經(jīng)元在行為過程中活動關(guān)聯(lián)性的變化趨勢及相應(yīng)的調(diào)控模式。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. 研究 Ezh2 對神經(jīng)干細胞產(chǎn)生新生神經(jīng)元以及神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)控機制 ； 2. 分析 NP1,NP2 條件敲除小鼠脊髓背角神經(jīng)元的軸樹突投射是否發(fā)生異常 ； 3. 研究 Rab10 效應(yīng)蛋白對神經(jīng)元極化的影響 ； 4. 研究新篩選出基因?qū)渫话l(fā)育與突觸功能的調(diào)節(jié)作用；觀察MeCP2 轉(zhuǎn)基因小鼠中突觸發(fā)育是否受到影響 ； 5. 研究神經(jīng)調(diào)質(zhì)受體與 Na+通道亞型在軸突始段的共存關(guān)系，研究Mauthner 細胞上的視覺輸入如何受到多巴胺系統(tǒng)的門控 ； 6. 檢測對味覺和嗅覺都有反應(yīng)的神經(jīng)元的性質(zhì)；研究 STDP 在初級視皮層群體神經(jīng)元中的作用 ； 7. 記錄多巴胺等神經(jīng)調(diào)質(zhì)如何改變神經(jīng)元內(nèi)在興奮性和突觸傳入。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 檢測 Sirt1 對神經(jīng)干細胞庫的影響；研究 Ezh2 對新生神經(jīng)元的調(diào)控 ； 2. 收集和制備實驗所需的各種轉(zhuǎn)基因小鼠；尋找決定 Gad67 時空正確表達的調(diào)控序列 ； 3. 確定 Slit/Robo 在大腦皮層神經(jīng)元遷移中的作用及分子機理 ； 4. 發(fā)展檢測 Rab5 和 Rab10 等活性的靈敏 FRET 探針 ； 5. 篩選可被神經(jīng)元電活動調(diào)控的，調(diào)節(jié)樹突形態(tài)與突觸功能的新基因；篩選 MeCP2 調(diào)控基因 ； 6. 鑒定皮層錐體細胞的軸突通道亞型及其電壓依賴特性；研究視覺如何調(diào)節(jié) Mauthner 細胞的聽覺和行為 ； 7. 通過電生理和鈣影像技術(shù)尋找果蠅味覺二級和高級神經(jīng)元以及嗅覺三級神經(jīng)元； V1 神經(jīng)元集群的時序?qū)W習(xí)與記憶 ； 8. 建立小鼠的工作記憶的行為范式，光遺傳手段，以及相關(guān)生理和行為學(xué)的檢測；研究果蠅中抉擇行為的動態(tài)性，及其涉及的神經(jīng)環(huán)路與機制 ； 9. 建立生物學(xué)上合理的大尺度的神經(jīng)元環(huán)路模型 ； 10. 研究 CDKL5 和 MeCP2 的相互關(guān)系。理論的結(jié)果和預(yù)測 將對 動物實驗的設(shè)計和數(shù)據(jù)分析 提供新的思路 。 已獲得 一些與本課題相關(guān)的前期工作成果 。 可行性分析 ： 已建立實驗必需的雞胚和鼠胚電場轉(zhuǎn)基因、 單細胞遷移導(dǎo)向分析、 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)、 病毒包裝感染等關(guān)鍵技術(shù) 。同時，將研究病理狀態(tài)下（包括癲癇、智障和老年癡呆）神經(jīng)環(huán)路的變化。 5) 開展 與臨床研究人員的 交流與 合作關(guān)系， 以擴展具有 臨床應(yīng)用前景 的基礎(chǔ)研究 。 建立從微觀的分子 /細胞水平研究 與 宏觀的系統(tǒng) /行為 研究 之間的橋梁 。 4) 五 個課題 有機聯(lián)系、 技術(shù)交叉 。這些課題緊密圍繞神經(jīng)環(huán)路的形成及功能展開研究。神經(jīng)元遷移和軸突投射的研究中，特別關(guān)注已知的神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子對新生神經(jīng)元遷移發(fā)揮的作用 、 闡明相關(guān)的信號機制。 創(chuàng)新點與特色 ： 圍繞神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、突觸的形成及修剪機制，從細胞骨架、囊泡轉(zhuǎn)運、基因表達調(diào)控等多層次多角度 地 展開研究 。 課題四 工作記憶和抉擇行為的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ) 本課題采用實驗和理論相結(jié)合的方法，圍繞工作記憶和抉擇行為的神經(jīng)環(huán)路機制展開深入研究。 創(chuàng)新點和特色 ： 從神經(jīng)環(huán)路的形成 與功能的層面來了解 腦 疾病 發(fā)病機理， 以期為 開發(fā)有臨床運用前景的預(yù)防與治療方法提供新思路。觀察到的模式動物在工作記憶和抉擇任務(wù)中的行為規(guī)律，完善工作記憶和抉擇行為的神經(jīng)元環(huán)路模型 ； 9. 觀察 kenyon神經(jīng)元軸突與用多巴胺、 octopamine、 GABA 等為遞質(zhì)侵入蘑菇體內(nèi)的神經(jīng)元纖維末梢的聯(lián)接規(guī)則及支配 關(guān)系 ； 10. 研究 敲除 ErbB4 基因的小鼠癲癇發(fā)生發(fā)展過程， 研究鈣離子是否介導(dǎo) RPC6 對 Aβ 水平的影響 ； 11. 研究 GAT1 敲除小鼠中前額葉腦區(qū) GABA 能緊張性電流；研究BDNFTrkB 信號通路對 ASIC 的影響，尋找 ASIC 上精胺敏化的位點。探討各種工作記憶機制的合理性 ； 9. 研究 敲除 ErbB4 基因的小鼠的突觸傳遞， MeCP2 和 CDKL5 敲除小鼠的學(xué)習(xí)行為， 研究過表達TRPC6 通道影響 g 分泌酶的活性，檢測 AD 鼠中過表達 TRPC6通道對學(xué)習(xí)和記憶能力 ； 10. 檢測 GAT1 敲除小鼠類精分癥狀的作用 , ASIC 如何參與 BDNF 對于神經(jīng)環(huán)路的調(diào)節(jié)作用。 TRPC6 通過下調(diào) Aβ 的產(chǎn)生減少其對突觸的毒性，改善了行為 。 主要研究內(nèi)容 ： 1. 大腦皮層 和脊髓背角神經(jīng)元產(chǎn)生及神經(jīng)遞質(zhì)表型決定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機 制； 2. miRNA 在大腦皮層神經(jīng)細胞命運決定、定向遷移、軸樹突分化、軸突生長導(dǎo)向中的作用 ； 3. 大腦皮層及脊髓神經(jīng)元有序遷移及軸突投射的導(dǎo)向機制 。工作記憶所儲存的信息包括抉擇時刻的外部刺激、動物本身的需求和相關(guān)的回憶，是動物做出合理抉擇的關(guān)鍵；反之，抉擇行為的結(jié)果又決定了動物工作記憶的內(nèi)容和模式，并將行為的后果存入 及 更替過去的 記憶。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，建立完善 的信號時空動態(tài)實驗體系 ，重點加強高分辨、新模態(tài)顯微成像 和 分子探針 平臺， 發(fā)展顯微圖像實時處理和三維重構(gòu)技術(shù)，爭取實現(xiàn)若干關(guān)鍵技術(shù)的自主創(chuàng)新； 2. 闡明 細胞 鈣信號納米尺度局部控制機制和鈣 穩(wěn)態(tài)維持條件。一方面是針對參與鈣信號和 ROS 相互作用的關(guān)鍵蛋白，利用基因敲除、定點突變等遺 傳干預(yù)手段“牽一發(fā)而動全身”，通過單因素變化導(dǎo)致的多因素變化來推斷多信號體系內(nèi)的調(diào)控關(guān)系；另一方面在大量時空動態(tài)實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，從控制原理和優(yōu)化理論的角度研究系統(tǒng)的性質(zhì)，揭示微觀隨機信號形成系統(tǒng)穩(wěn)健性的原理。用獨立成分分析以及去卷積計算細胞信號的時空序列。在分子水平 上 ，研究重要信號蛋白 的 動態(tài) 行為及相互作用 ； 在細胞 器水平 上， 研究鈣信號、 ROS 信號的動態(tài)及其與信號蛋白的相互作用 ； 在細胞 水平 上， 研究 鈣信號螺旋波，鈣信號與 ROS 信號相互 作用 ，信號蛋白的 空間定位和 調(diào)控 網(wǎng)絡(luò)等；在整體水平 上 ，將采用基因敲除鼠和轉(zhuǎn)基因鼠 方法， 研究信號蛋白的功能 及其整合調(diào)控關(guān)系。 本項目提托中關(guān)村地區(qū)的學(xué)術(shù)環(huán)境優(yōu)勢，發(fā)揮綜合大學(xué)的多學(xué)科攻關(guān)優(yōu)勢，利用多個國家級研究基地的資源優(yōu)勢，包括生物膜與膜生物工程國家重點實驗室、分子科學(xué)國家實驗室、生物大分子國家重點實驗室等。這是基于我們以往對細胞信號隨機動態(tài)的深入研究，經(jīng)過多次跨學(xué)科研討，凝練