【正文】 （ 3） 構建主要育種性狀的 GP 模型和相應數(shù)據(jù)庫 。找尋 SNP 位點和微衛(wèi)星位點 ， 優(yōu)化大規(guī)模發(fā)掘 SNP 等標記技術體系；對作圖家系進行傳代培養(yǎng)。 3）珍珠質形成相關功能基因的表達調控機制 ：利用 EMS、 RNAi、 DnaseI footprinting 和酵母雙雜交等技術研究與珍珠質量有關性狀相關的功能基因的轉錄調控規(guī)律及信號轉導通路， 闡明相關功能基因的表達調控網(wǎng)絡及調控機制。 3）知識產(chǎn)權和人才培養(yǎng) ：發(fā)表 SCI 論文 50 篇以上，其中影響因子 ? 論文 4 篇，申請國家或國際發(fā)明專利 10 個以上；培養(yǎng)碩士 20 名，博士 15 名、博士后 3 人以上。 2）貝類的高密度遺傳圖譜構建 選擇 SNP 等標記，利用參考家系，構建牡蠣、扇貝和珍珠貝高密度的遺傳連鎖圖譜。 2）基因組注釋以及重要性狀相關基因的規(guī)模篩選 ：確定貝類基因組特征，實現(xiàn)基于 GO 和 KEGG 的基因功能注釋與分類； 批量篩選出與生長、抗逆和珍珠質形成等重要經(jīng)濟性狀相關的候選基因 。通過國際合作和學術交流，有利于項目的順利實施和預期成果的取得。上述技術研發(fā)為項目 實施和取得預期成果 提供了方法學支撐。 貝類珍珠質形成的關鍵基因及其網(wǎng)絡調控機制 利用比較基因組學和生物信息學方法，基于牡蠣等全基因組序列信息，篩選珍珠質形成相關的功能基因，采用 cDNA 微陣列等技術研究功能和表達；利用體外轉錄因子結合實驗（ EMS）、免疫共沉淀、 RNAi 和酵母雙雜交等技術研究功能基因的轉錄調控機理及信號轉導通路；利用體外碳酸鈣結晶和免疫金標等技術研究基質蛋白對珍珠質形成的調控作用；采用相關 /關聯(lián)分析，開展生長性狀相關的 QTL 定位，鑒定功能性 SNP 位點， 確定單倍型與優(yōu)質珍珠形成的關系。構建基因型和表型性狀關聯(lián)的GP 模型和相應數(shù)據(jù)庫，為貝類分子設計育種提供關鍵 技術 ；對貝類從基因到整體不同層次進行設計和操作，進而在計算機平臺上對育種程序中的各種因素和重要經(jīng)濟 性狀進行模擬、篩選和優(yōu)化，提出分子設計育種的策略和可行性途徑。 培養(yǎng)和建立一支國際一流的創(chuàng)新團隊，獲得一批具自主知識產(chǎn)權的原創(chuàng)成果 造就一批在國內外頗有影響力的中青年學科帶頭人，打造一支以中青年為主體具高度自主創(chuàng)新能力的團隊；培養(yǎng)碩士 100 名，博士 80 名、 博士后 20 名以上。 二、預期目標 （一）總體目標 完成牡蠣基因組的全面解析及其與扇貝和珍珠貝基因組比較研究，明確貝類基因組的結構和特征；批量篩選功能基因和 SNP 標記，構建高密度遺傳圖譜；發(fā)掘生長、發(fā)育、抗性和珍珠質形成等性狀相關的關鍵基因，研究和驗證基因的功能和調控機制，揭示性狀的基因調控網(wǎng)絡；開展分子設計育種技術途徑研究，為分子設計育種 提供理論基礎和技術支持。本關鍵科學問題包含 4 個重要內涵： ① 目標性狀基因 /QTL 的精細定位； ② 重要經(jīng)濟性狀的關鍵基因及其作用機理； ③ 基因表達調控網(wǎng)絡； ④基因型與表型的關聯(lián)性。 第 五 年 1. 重要功能基因的信號傳遞及其調控機制研究； 2. 在雌核發(fā)育和近交家系中候選QTL 與抗病力的關聯(lián)性分析； 3. 利用重要功能基因或分子標記進行分子設計育種可行性評價； 4. 魚類主效基因標記及基因不同組合的遺傳效應與育種效率評估研究； 5. 基于蛋白質鋅指結構的魚類基因快速敲除系統(tǒng) 的 完善和優(yōu)化； 6. 建立穩(wěn)定遺傳、快速生長的轉持續(xù)激活生長激素受體基因魚家系 ， 建立原生殖細胞操作技術并獲得可控不育遺傳安全的轉基因魚 ， 小 RNA分子在性分化過程 的分子調控機理研究。 1. 解析重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀相關組織的轉錄組信息； 2. 鑒定調控魚類生殖、生長、抗病和抗寒的功能基因或分子標記 610個； 3. 構建在養(yǎng)殖魚類肌肉組織中高表達抑肌素抑制蛋白的轉基因魚 F0代； 4. 建立牙鲆細菌病抗性群體和易感群體； 5. 建立轉座子介導的抗寒候選基因轉移體系，使候選基因在子一代魚中出現(xiàn)的頻率比用質粒轉移提高 3倍以上 ； 6. 獲得多基因性狀基因遺傳分析的鯉魚家系材料 910 個，獲得微衛(wèi)星和 SNP 約 2020 個， AFLP 標記 1000多個； 7. 獲得多種轉座子元件介導的轉基因魚 ， 獲得三聯(lián)體鋅指蛋白表達質粒和哺乳動物細胞系單雜交系統(tǒng)特異性檢測 質粒； 8. 獲得魚類生長激素受體基因及其持續(xù)激活形式的分子設計 ， 獲得原生質細胞特異表達基因 ， 獲得性腺相關的小 RNA。 承 擔 單 位 ： 中國科學院水生生物研究所 、中山大學 課題負責人 ： 殷戰(zhàn) 主要學術骨干 ： 林浩然 、 李文笙 、黃安林、 賀江燕、 王緒禎 、 陳尚萍 經(jīng)費比例： 16% 課題 3 魚類抗病基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 主要研究目標： 闡明魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調控網(wǎng)絡和抗病作用機理；揭示在魚類抗病免疫反應中主效基因的表達調控機制；闡明重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關的分子標記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設計育種的理論和技術方法， 開拓其可行性途徑； 主要研究內容： 魚類干擾素系統(tǒng)基因的功能解析、調控網(wǎng)絡和作用機理研究； 重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制研究； 魚類抗細菌免疫基因的信號調控網(wǎng)絡、功能分析和抗病機理研究； 具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系的創(chuàng)制和篩選； 與抗病性狀相關的分子標記和等位基因的鑒定及其抗病 QTL 定位研究； 魚類抗病分子設計育種的理論和技術方法的建立及其可行性途徑研究。 （五）、 課題設置 圍繞項目所要解決的魚類分子設計育種的策略和理論基礎以及魚類分子設計育種的 可行性途徑這兩個 關鍵科學問題，以 及項目所要達到為魚類分子設計育種的實踐與應用和為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與漁業(yè)生物技術的創(chuàng)新做出貢獻的預期目標，根據(jù)項目所要進行的主要研究內容（研究魚類生殖、生長、抗性的基因調控網(wǎng)絡及其作用機理，篩選鑒定可用于分子設計育種的關鍵基因和分子標記，建立魚類分子設計育種的關鍵技術及其技術體系），項目共設置 6 個課題。將含有這些基因的真核表達載體，或在大腸桿菌中表達出的蛋白，注射到胚胎中或轉染到細胞中，觀察生物學效應； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學效應； 12. 對生殖調控基因而言，設立人工性反轉實驗，分別提取不同性反轉階段實驗組和對照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達的時序性； 13. 對生長和生殖功能基因而言，合成重要調控生長生殖基因的結構類似物或表達具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細胞孵育等離體研究方法，或直接注射結構類似物或重組蛋白，采用放射免疫測定等方法研究其活性，測定各種靶組織、血清中調控生殖生長激素的含量，分析這些生長調控因子和生殖調控因子的相互作 用及其信號傳遞機制，分析它們對魚類生殖和生長的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實驗室日常工作的、簡潔、高效的 siRNA 技術平臺；通過克隆獲得的魚類來源的啟動子構建針對草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉 siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導的系統(tǒng)進行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細胞和生殖干細胞系，建立魚類培養(yǎng)細胞體外基因操作和個體重建技術途徑； 15. 通過 morpholino 介導的基因敲降技術，配合整體原位雜交、細胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學功能及其基因調控網(wǎng)絡、信號通路和作用機理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細胞模型，研究病毒與宿主細胞的相互作用，在此基礎上，通過轉染目的基因和 siRNA 干擾等技術手段，研究目的基因的生理學功能以及基因的調控網(wǎng)絡； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟性狀相關的分子遺傳標記，進而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標記進行基因型分析的優(yōu)勢，研究特定標記與某些經(jīng)濟性狀（例如生長、性別、抗病或抗寒）的連鎖關系，進行分子標 記輔助育種；開展魚類生長、飼料轉化率等經(jīng)濟性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質鋅指結構的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點，以簡化特異基因敲除載體的構建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進行鋅指結構域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個氨基酸的合適結構域，依據(jù)針對 DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗鋅指氨基酸序列，設計靶標多肽和堿基序列；將靶標多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測顯微注射個體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個體擴大培養(yǎng)，并進行相互交配，以獲得基因的兩個拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設計、 BAC 克隆、轉座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉基因技術，優(yōu)化和完善基于蛋白質鋅指結構的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉基因技術體系 等建立可用于魚類分子設計育種的基因操作技術路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達調控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調控途徑，研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉基因魚，揭示持續(xù)轉激活生長激素受體基因與轉生長激素基因的轉基因魚的效應及其信號通路的調控差異。 3） 魚類抗性的基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細胞模型，重點解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調控網(wǎng)絡和抗病作用機理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；探討在魚類抗病免疫反應中主效基因調控網(wǎng)絡、功能和抗病機理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關的分子標記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設計育種的理論和技術方法，開拓其可行性途徑。 （二）、技術途徑： 1. 采用 solexa 深度測序等大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉錄組學分析，了解魚類生殖和生長不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達譜差異，經(jīng)生物信息學比較和分子特征分析，由此篩選調控魚類生殖、生長、抗性的主要基因和關鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫，研究 基因的結構，克隆分離相應基因的啟動子；將其啟動子與 GFP 報告基因重組融合，利用基因轉移等技術，采用流式細胞儀等篩選分析技術，進一步研究生物學功能； 3. 建立魚類 BAC 轉基因技術，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構件制備轉基因魚，通過 EGFP 分析這些基因的時空表達情況及其生理學效應； 4. 通過基因連鎖分析和原位雜交等技術，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測基因表達的組織特異性和時序性 。本項目的研究內容是在這些基礎上進一步凝聚而來，目標更為明確。 主要研究內容： 魚類生殖質 的 成分解析及其基因調控網(wǎng)絡研究； 魚類生殖質主要成分的功能及其作用機制研究； 魚類配子發(fā)生過程中特異性甲基化等位基因功能及其調控網(wǎng)絡研究； 魚類卵母細胞特異組蛋白、 Spindlin 在卵子成熟中的作用及調控機制研究； 魚類卵 胚轉換的調控機制研究； 魚類性別決定和性別分化的基因調控網(wǎng)絡、功能解析和作用機理研究； 魚類性別特異表達基因和分子標記的鑒定及其分子設計育種可行性研究。 承擔單位： 中國科學院水生生物研究所、中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 課題負 責人 ： 童金茍 主要學術骨干 ： 孫效文 、王忠衛(wèi)、俞小牧、張驍鋒、耿波、賈智英、梁利群 經(jīng)費比例： 16% 課題 6 基于魚類分子設計育種的基因操作技術研究 主要研究目標： 創(chuàng)制基于蛋白分子設計、 BAC 克隆、轉座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉基因技術；優(yōu)化和完善基于蛋白質鋅指結構的魚類基因快速敲除系統(tǒng)；揭示性腺特異小 RNA 在基因表達調控中的新途徑，闡明 piRNA 與互作蛋白及其調控途徑；創(chuàng)建基于破壞原生殖細胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉基因技術體系；研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉 基因魚；揭示持續(xù)轉激活生長激素受體基因與轉生長激素基因的轉基因魚的效應及其信號通路的調控差異。 、生長、抗病和抗寒的功能基因或分子標記 1015個； 23個重要基因在生殖質的形成和遷移、卵母細胞成熟、卵胚轉換以及性別決定和分化中的功能；確定基因啟動子的差異甲基化修飾在其表達和生