【正文】 （ 3） 構(gòu)建主要育種性狀的 GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫 。找尋 SNP 位點(diǎn)和微衛(wèi)星位點(diǎn) ， 優(yōu)化大規(guī)模發(fā)掘 SNP 等標(biāo)記技術(shù)體系；對(duì)作圖家系進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 3）珍珠質(zhì)形成相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制 ：利用 EMS、 RNAi、 DnaseI footprinting 和酵母雙雜交等技術(shù)研究與珍珠質(zhì)量有關(guān)性狀相關(guān)的功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 闡明相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。 3）知識(shí)產(chǎn)權(quán)和人才培養(yǎng) ：發(fā)表 SCI 論文 50 篇以上，其中影響因子 ? 論文 4 篇，申請(qǐng)國家或國際發(fā)明專利 10 個(gè)以上；培養(yǎng)碩士 20 名，博士 15 名、博士后 3 人以上。 2）貝類的高密度遺傳圖譜構(gòu)建 選擇 SNP 等標(biāo)記，利用參考家系，構(gòu)建牡蠣、扇貝和珍珠貝高密度的遺傳連鎖圖譜。 2）基因組注釋以及重要性狀相關(guān)基因的規(guī)模篩選 ：確定貝類基因組特征，實(shí)現(xiàn)基于 GO 和 KEGG 的基因功能注釋與分類； 批量篩選出與生長(zhǎng)、抗逆和珍珠質(zhì)形成等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因 。通過國際合作和學(xué)術(shù)交流，有利于項(xiàng)目的順利實(shí)施和預(yù)期成果的取得。上述技術(shù)研發(fā)為項(xiàng)目 實(shí)施和取得預(yù)期成果 提供了方法學(xué)支撐。 貝類珍珠質(zhì)形成的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于牡蠣等全基因組序列信息，篩選珍珠質(zhì)形成相關(guān)的功能基因，采用 cDNA 微陣列等技術(shù)研究功能和表達(dá)；利用體外轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn)（ EMS）、免疫共沉淀、 RNAi 和酵母雙雜交等技術(shù)研究功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；利用體外碳酸鈣結(jié)晶和免疫金標(biāo)等技術(shù)研究基質(zhì)蛋白對(duì)珍珠質(zhì)形成的調(diào)控作用；采用相關(guān) /關(guān)聯(lián)分析，開展生長(zhǎng)性狀相關(guān)的 QTL 定位，鑒定功能性 SNP 位點(diǎn)， 確定單倍型與優(yōu)質(zhì)珍珠形成的關(guān)系。構(gòu)建基因型和表型性狀關(guān)聯(lián)的GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，為貝類分子設(shè)計(jì)育種提供關(guān)鍵 技術(shù) ；對(duì)貝類從基因到整體不同層次進(jìn)行設(shè)計(jì)和操作，進(jìn)而在計(jì)算機(jī)平臺(tái)上對(duì)育種程序中的各種因素和重要經(jīng)濟(jì) 性狀進(jìn)行模擬、篩選和優(yōu)化，提出分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性途徑。 培養(yǎng)和建立一支國際一流的創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，獲得一批具自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)成果 造就一批在國內(nèi)外頗有影響力的中青年學(xué)科帶頭人，打造一支以中青年為主體具高度自主創(chuàng)新能力的團(tuán)隊(duì)；培養(yǎng)碩士 100 名，博士 80 名、 博士后 20 名以上。 二、預(yù)期目標(biāo) （一）總體目標(biāo) 完成牡蠣基因組的全面解析及其與扇貝和珍珠貝基因組比較研究，明確貝類基因組的結(jié)構(gòu)和特征；批量篩選功能基因和 SNP 標(biāo)記，構(gòu)建高密度遺傳圖譜；發(fā)掘生長(zhǎng)、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，揭示性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；開展分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)途徑研究，為分子設(shè)計(jì)育種 提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。本關(guān)鍵科學(xué)問題包含 4 個(gè)重要內(nèi)涵： ① 目標(biāo)性狀基因 /QTL 的精細(xì)定位； ② 重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因及其作用機(jī)理； ③ 基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； ④基因型與表型的關(guān)聯(lián)性。 第 五 年 1. 重要功能基因的信號(hào)傳遞及其調(diào)控機(jī)制研究； 2. 在雌核發(fā)育和近交家系中候選QTL 與抗病力的關(guān)聯(lián)性分析； 3. 利用重要功能基因或分子標(biāo)記進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種可行性評(píng)價(jià)； 4. 魚類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評(píng)估研究； 5. 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng) 的 完善和優(yōu)化； 6. 建立穩(wěn)定遺傳、快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚家系 ， 建立原生殖細(xì)胞操作技術(shù)并獲得可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚 ， 小 RNA分子在性分化過程 的分子調(diào)控機(jī)理研究。 1. 解析重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄組信息； 2. 鑒定調(diào)控魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 610個(gè)； 3. 構(gòu)建在養(yǎng)殖魚類肌肉組織中高表達(dá)抑肌素抑制蛋白的轉(zhuǎn)基因魚 F0代； 4. 建立牙鲆細(xì)菌病抗性群體和易感群體； 5. 建立轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的抗寒候選基因轉(zhuǎn)移體系，使候選基因在子一代魚中出現(xiàn)的頻率比用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移提高 3倍以上 ； 6. 獲得多基因性狀基因遺傳分析的鯉魚家系材料 910 個(gè)，獲得微衛(wèi)星和 SNP 約 2020 個(gè)， AFLP 標(biāo)記 1000多個(gè)； 7. 獲得多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因魚 ， 獲得三聯(lián)體鋅指蛋白表達(dá)質(zhì)粒和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系單雜交系統(tǒng)特異性檢測(cè) 質(zhì)粒； 8. 獲得魚類生長(zhǎng)激素受體基因及其持續(xù)激活形式的分子設(shè)計(jì) ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因 ， 獲得性腺相關(guān)的小 RNA。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所 、中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 殷戰(zhàn) 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 林浩然 、 李文笙 、黃安林、 賀江燕、 王緒禎 、 陳尚萍 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 3 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示在魚類抗病免疫反應(yīng)中主效基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制；闡明重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法， 開拓其可行性途徑； 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類干擾素系統(tǒng)基因的功能解析、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)理研究； 重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制研究； 魚類抗細(xì)菌免疫基因的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能分析和抗病機(jī)理研究； 具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系的創(chuàng)制和篩選； 與抗病性狀相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因的鑒定及其抗病 QTL 定位研究； 魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法的建立及其可行性途徑研究。 （五）、 課題設(shè)置 圍繞項(xiàng)目所要解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題，以 及項(xiàng)目所要達(dá)到為魚類分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐與應(yīng)用和為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)的預(yù)期目標(biāo)，根據(jù)項(xiàng)目所要進(jìn)行的主要研究?jī)?nèi)容（研究魚類生殖、生長(zhǎng)、抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定可用于分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系），項(xiàng)目共設(shè)置 6 個(gè)課題。將含有這些基因的真核表達(dá)載體，或在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 12. 對(duì)生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達(dá)的時(shí)序性； 13. 對(duì)生長(zhǎng)和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長(zhǎng)生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達(dá)具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細(xì)胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測(cè)定等方法研究其活性，測(cè)定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長(zhǎng)激素的含量，分析這些生長(zhǎng)調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號(hào)傳遞機(jī)制，分析它們對(duì)魚類生殖和生長(zhǎng)的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實(shí)驗(yàn)室日常工作的、簡(jiǎn)潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺(tái)；通過克隆獲得的魚類來源的啟動(dòng)子構(gòu)建針對(duì)草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞系，建立魚類培養(yǎng)細(xì)胞體外基因操作和個(gè)體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學(xué)功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)通路和作用機(jī)理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細(xì)胞模型，研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學(xué)功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標(biāo)記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因型分析的優(yōu)勢(shì)，研究特定標(biāo)記與某些經(jīng)濟(jì)性狀（例如生長(zhǎng)、性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助育種；開展魚類生長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟(jì)性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點(diǎn)，以簡(jiǎn)化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進(jìn)行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個(gè)氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對(duì) DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗(yàn)鋅指氨基酸序列，設(shè)計(jì)靶標(biāo)多肽和堿基序列；將靶標(biāo)多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進(jìn)后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測(cè)顯微注射個(gè)體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個(gè)體擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行相互交配，以獲得基因的兩個(gè)拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長(zhǎng)激素受體基因與轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應(yīng)及其信號(hào)通路的調(diào)控差異。 3） 魚類抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細(xì)胞模型，重點(diǎn)解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；探討在魚類抗病免疫反應(yīng)中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能和抗病機(jī)理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法，開拓其可行性途徑。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測(cè)序等大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，了解魚類生殖和生長(zhǎng)不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達(dá)譜差異，經(jīng)生物信息學(xué)比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚類生殖、生長(zhǎng)、抗性的主要基因和關(guān)鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應(yīng)基因的啟動(dòng)子；將其啟動(dòng)子與 GFP 報(bào)告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細(xì)胞儀等篩選分析技術(shù)，進(jìn)一步研究生物學(xué)功能； 3. 建立魚類 BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當(dāng)位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚，通過 EGFP 分析這些基因的時(shí)空表達(dá)情況及其生理學(xué)效應(yīng)； 4. 通過基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎(chǔ)； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測(cè)基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)序性 。本項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容是在這些基礎(chǔ)上進(jìn)一步凝聚而來，目標(biāo)更為明確。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類生殖質(zhì) 的 成分解析及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類生殖質(zhì)主要成分的功能及其作用機(jī)制研究； 魚類配子發(fā)生過程中特異性甲基化等位基因功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類卵母細(xì)胞特異組蛋白、 Spindlin 在卵子成熟中的作用及調(diào)控機(jī)制研究； 魚類卵 胚轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制研究； 魚類性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能解析和作用機(jī)理研究； 魚類性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記的鑒定及其分子設(shè)計(jì)育種可行性研究。 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院水生生物研究所、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 課題負(fù) 責(zé)人 ： 童金茍 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 孫效文 、王忠衛(wèi)、俞小牧、張驍鋒、耿波、賈智英、梁利群 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 6 基于魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)研究 主要研究目標(biāo)： 創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)；優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)；揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的新途徑，闡明 piRNA 與互作蛋白及其調(diào)控途徑；創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系；研制出持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的轉(zhuǎn) 基因魚；揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長(zhǎng)激素受體基因與轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應(yīng)及其信號(hào)通路的調(diào)控差異。 、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 1015個(gè)； 23個(gè)重要基因在生殖質(zhì)的形成和遷移、卵母細(xì)胞成熟、卵胚轉(zhuǎn)換以及性別決定和分化中的功能；確定基因啟動(dòng)子的差異甲基化修飾在其表達(dá)和生