【正文】 性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助育種；開展魚類生長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟(jì)性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點(diǎn)，以簡(jiǎn)化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進(jìn)行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個(gè)氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對(duì) DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗(yàn)鋅指氨基酸序列，設(shè)計(jì)靶標(biāo)多肽和堿基序列；將靶標(biāo)多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進(jìn)后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測(cè)顯微注射個(gè)體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個(gè)體擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行相互交配，以獲得基因的兩個(gè)拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 （四）、可行性分析： 1) 厚實(shí)的前期研究基礎(chǔ)，目標(biāo)明確： 魚類等水產(chǎn)動(dòng)物的分子設(shè)計(jì)育種研究雖然還處于起步階段，但可喜的是，隨著斑馬魚、河 鲀 和青 鳉 等模式魚類全基因組測(cè)序的完成和基因功能研究的不斷深入，一些重要養(yǎng)殖魚類的功能基因組研究已進(jìn)展很快，特別是我們這個(gè)團(tuán)隊(duì)在上一期 973 計(jì)劃 “ 重要魚 類品種改良的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)研究 ” 的支持下，已篩選鑒定出一批與我國(guó)主要養(yǎng)殖魚類的生殖、生長(zhǎng)、抗性等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因和分子標(biāo)記，建立了 10 多個(gè)養(yǎng)殖魚類細(xì)胞系， 積累了 厚實(shí)的前期研究基礎(chǔ)。 （五）、 課題設(shè)置 圍繞項(xiàng)目所要解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題，以 及項(xiàng)目所要達(dá)到為魚類分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐與應(yīng)用和為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)的預(yù)期目標(biāo)，根據(jù)項(xiàng)目所要進(jìn)行的主要研究?jī)?nèi)容（研究魚類生殖、生長(zhǎng)、抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定可用于分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系），項(xiàng)目共設(shè)置 6 個(gè)課題。 課題 1 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示魚類生殖質(zhì)主要成分的功能及其作用機(jī)制；闡明魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類卵母細(xì)胞特異組蛋白、 Spindlin等與魚類卵子成熟調(diào)控和卵 胚轉(zhuǎn)換機(jī)制；揭示魚類性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育 種的可行性途徑。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 、中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 殷戰(zhàn) 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 林浩然 、 李文笙 、黃安林、 賀江燕、 王緒禎 、 陳尚萍 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 3 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示在魚類抗病免疫反應(yīng)中主效基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制；闡明重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法， 開拓其可行性途徑； 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類干擾素系統(tǒng)基因的功能解析、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)理研究； 重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制研究； 魚類抗細(xì)菌免疫基因的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能分析和抗病機(jī)理研究； 具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系的創(chuàng)制和篩選； 與抗病性狀相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因的鑒定及其抗病 QTL 定位研究； 魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法的建立及其可行性途徑研究。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)研究； 魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性研究； 魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組分析以及在群體和家系中的功能研究； 魚類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評(píng)估研究； 可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合技術(shù)研究。 1. 解析重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄組信息； 2. 鑒定調(diào)控魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 610個(gè)； 3. 構(gòu)建在養(yǎng)殖魚類肌肉組織中高表達(dá)抑肌素抑制蛋白的轉(zhuǎn)基因魚 F0代； 4. 建立牙鲆細(xì)菌病抗性群體和易感群體； 5. 建立轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的抗寒候選基因轉(zhuǎn)移體系，使候選基因在子一代魚中出現(xiàn)的頻率比用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移提高 3倍以上 ； 6. 獲得多基因性狀基因遺傳分析的鯉魚家系材料 910 個(gè)，獲得微衛(wèi)星和 SNP 約 2020 個(gè)， AFLP 標(biāo)記 1000多個(gè)； 7. 獲得多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因魚 ， 獲得三聯(lián)體鋅指蛋白表達(dá)質(zhì)粒和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系單雜交系統(tǒng)特異性檢測(cè) 質(zhì)粒； 8. 獲得魚類生長(zhǎng)激素受體基因及其持續(xù)激活形式的分子設(shè)計(jì) ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因 ， 獲得性腺相關(guān)的小 RNA。 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. 魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的重要基因的功能分析； 2. 基因啟動(dòng)子的差異甲基化修飾在表達(dá)和生殖調(diào)控中的作用研究； 3. 不同尺寸魚類物種的分子系統(tǒng)學(xué)分析； 4. 創(chuàng)制育種上有價(jià)值的雌核發(fā)育系和近交家系； 5. 羅非魚轉(zhuǎn)抗寒基因研究 ； 6. 繼續(xù)遺傳圖譜構(gòu)建和 QTL 標(biāo)記或主效基因的基因型 表型的測(cè)量和分析； 7. 穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因模型和 Cre/lox 基因靶位操作模型的建立；基因敲除斑馬魚的 +/ 子代個(gè)體 的獲得 ； 8. 轉(zhuǎn)持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因魚 F1 代的篩選、鑒定及其信號(hào)通路活性分析 ， 原生殖細(xì)胞特異基因的分子設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)基因初步試驗(yàn) ， 小 RNA作用靶基因的研究，繼續(xù)互作蛋白的研究。 第 五 年 1. 重要功能基因的信號(hào)傳遞及其調(diào)控機(jī)制研究； 2. 在雌核發(fā)育和近交家系中候選QTL 與抗病力的關(guān)聯(lián)性分析； 3. 利用重要功能基因或分子標(biāo)記進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種可行性評(píng)價(jià)； 4. 魚類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評(píng)估研究； 5. 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng) 的 完善和優(yōu)化； 6. 建立穩(wěn)定遺傳、快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚家系 ， 建立原生殖細(xì)胞操作技術(shù)并獲得可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚 ， 小 RNA分子在性分化過程 的分子調(diào)控機(jī)理研究。 貝類基因組結(jié) 構(gòu)與特征 基因組信息是解析經(jīng)濟(jì)性狀和實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)。本關(guān)鍵科學(xué)問題包含 4 個(gè)重要內(nèi)涵： ① 目標(biāo)性狀基因 /QTL 的精細(xì)定位； ② 重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因及其作用機(jī)理； ③ 基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； ④基因型與表型的關(guān)聯(lián)性。 貝類比較基因組研究和 SNP 規(guī)模開發(fā) 在已有的牡蠣框架圖基礎(chǔ)上，利用物理圖譜和 BAC 文庫，構(gòu)建基因組精細(xì)圖；完善基因組注釋、對(duì)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分類，批量開發(fā)功能基因；開展牡蠣、扇貝和珍珠貝基因組的比較研究；規(guī)模開發(fā)貝類 SNP 標(biāo)記，建立牡 蠣等貝類高密度遺傳圖譜。 二、預(yù)期目標(biāo) （一）總體目標(biāo) 完成牡蠣基因組的全面解析及其與扇貝和珍珠貝基因組比較研究，明確貝類基因組的結(jié)構(gòu)和特征；批量篩選功能基因和 SNP 標(biāo)記，構(gòu)建高密度遺傳圖譜；發(fā)掘生長(zhǎng)、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，揭示性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；開展分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)途徑研究，為分子設(shè)計(jì)育種 提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。 取得一批國(guó)際一流成果，造就一批學(xué)科領(lǐng)軍人才，凝煉一支具高度創(chuàng)新能力的研究團(tuán)隊(duì)。 培養(yǎng)和建立一支國(guó)際一流的創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，獲得一批具自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)成果 造就一批在國(guó)內(nèi)外頗有影響力的中青年學(xué)科帶頭人，打造一支以中青年為主體具高度自主創(chuàng)新能力的團(tuán)隊(duì)；培養(yǎng)碩士 100 名，博士 80 名、 博士后 20 名以上。各課題研究?jī)?nèi)容既各有側(cè)重、又相互關(guān)聯(lián)，形成一個(gè)有序銜接和支撐的有機(jī)體；既有重大基礎(chǔ)理論研究，又有核心技術(shù)研發(fā)，符合生命科學(xué)領(lǐng)域重要基礎(chǔ)理論發(fā)展和重大關(guān)鍵技術(shù)突破相伴產(chǎn)生的規(guī)律，易形成重大成果。構(gòu)建基因型和表型性狀關(guān)聯(lián)的GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，為貝類分子設(shè)計(jì)育種提供關(guān)鍵 技術(shù) ；對(duì)貝類從基因到整體不同層次進(jìn)行設(shè)計(jì)和操作，進(jìn)而在計(jì)算機(jī)平臺(tái)上對(duì)育種程序中的各種因素和重要經(jīng)濟(jì) 性狀進(jìn)行模擬、篩選和優(yōu)化，提出分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性途徑。 主要的技術(shù)方法 ： 貝類基因組的比較與功能基因批量發(fā)掘 利用傳統(tǒng) Sanger 技術(shù)和第二代測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合物理圖譜和 BAC 文庫末端測(cè)序，對(duì) 基因組序列進(jìn)行 組裝和拼接，構(gòu)建牡蠣全基因組精細(xì)圖譜；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用 Genscan、 GO 和 KEGG 等工具進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和注釋；采用 Blast、PAML、 KaKs_Calculator 等工具，比較牡蠣、扇貝 和 珍珠貝基因組序列，篩選出重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的批量功能基 因。 貝類珍珠質(zhì)形成的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于牡蠣等全基因組序列信息，篩選珍珠質(zhì)形成相關(guān)的功能基因，采用 cDNA 微陣列等技術(shù)研究功能和表達(dá)；利用體外轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn)（ EMS）、免疫共沉淀、 RNAi 和酵母雙雜交等技術(shù)研究功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；利用體外碳酸鈣結(jié)晶和免疫金標(biāo)等技術(shù)研究基質(zhì)蛋白對(duì)珍珠質(zhì)形成的調(diào)控作用；采用相關(guān) /關(guān)聯(lián)分析，開展生長(zhǎng)性狀相關(guān)的 QTL 定位，鑒定功能性 SNP 位點(diǎn)， 確定單倍型與優(yōu)質(zhì)珍珠形成的關(guān)系。 良種分子設(shè)計(jì)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)取得突破 查清基因單倍型與性狀的對(duì)應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建基因型和表型性狀關(guān)聯(lián)的 GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，從基因到整體不同層次進(jìn)行 設(shè)計(jì)和操作，研發(fā)貝類模擬育種 技術(shù) 平臺(tái)。上述技術(shù)研發(fā)為項(xiàng)目 實(shí)施和取得預(yù)期成果 提供了方法學(xué)支撐。 已建成一支高素質(zhì)的研究團(tuán)隊(duì) 經(jīng)過國(guó)家多年的連續(xù)支持，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)形成以中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、中國(guó)海洋大學(xué)、廈門大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院南海海洋所 、 清華大學(xué) 、海南大學(xué)、深圳華大基 因研究院 等單位為主的基因組學(xué) 、生物信息學(xué)和 貝類 遺傳育種學(xué)基礎(chǔ)研究和技術(shù) 研 發(fā) 團(tuán)隊(duì)，培育出一批在國(guó)際上有影響的學(xué)術(shù)帶頭人，凝練了一支有很好合作基礎(chǔ)、高素質(zhì)、強(qiáng)創(chuàng)新能力的研究團(tuán)隊(duì)。通過國(guó)際合作和學(xué)術(shù)交流，有利于項(xiàng)目的順利實(shí)施和預(yù)期成果的取得。 整個(gè)項(xiàng)目針對(duì) 3 個(gè)科學(xué)問題，課題格局為 1 結(jié)構(gòu)，從總體上構(gòu)成了層層遞進(jìn)、相互銜接的有機(jī)整體。 2）基因組注釋以及重要性狀相關(guān)基因的規(guī)模篩選 ：確定貝類基因組特征，實(shí)現(xiàn)基于 GO 和 KEGG 的基因功能注釋與分類； 批量篩選出與生長(zhǎng)、抗逆和珍珠質(zhì)形成等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因 。 2）牡蠣全基因組注釋及功能基因的規(guī)模開發(fā) ：借助生物信息學(xué)分析軟件，對(duì)全基因組圖譜進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析、基因功能注釋 與 分類，開展轉(zhuǎn)錄組研究，豐富已有的 EST 和 cDNA 資源，規(guī)模開發(fā)功能基因。 2）貝類的高密度遺傳圖譜構(gòu)建 選擇 SNP 等標(biāo)記，利用參考家系，構(gòu)建牡蠣、扇貝和珍珠貝高密度的遺傳連鎖圖譜。 研究?jī)?nèi)容： 1）貝類生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因 /QTL 的篩選和功能 鑒定 ：利用 QTL 定位和全基因組序列篩選生長(zhǎng)相關(guān)基因，運(yùn)用功能 SNP 分析、關(guān)聯(lián)分析、蛋白組學(xué)等技術(shù)方法確定主效基因；利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法篩選、克隆參與調(diào)控貝類發(fā)育尤其是幼蟲變態(tài)和原生殼形成的關(guān)鍵基因；運(yùn)用生物信息學(xué)、 RNAi 和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)手段對(duì)發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行功能 鑒定 。 3）知識(shí)產(chǎn)權(quán)和人才培養(yǎng) ：發(fā)表 SCI 論文 50 篇以上，其中影響因子 ? 論文 4 篇，申請(qǐng)國(guó)家或國(guó)際發(fā)明專利 10 個(gè)以上；培養(yǎng)碩士 20 名，博士 15 名、博士后 3 人以上。 功能基因驗(yàn)證 ：明確 35 個(gè)功能基因與珍珠質(zhì)量的相關(guān)性，闡明其表達(dá)調(diào)控規(guī)律及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；確定 45種基質(zhì)蛋白在珍珠質(zhì)形成過程中的調(diào)控作用。 3）珍珠質(zhì)形成相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制 ：利用 EMS、 RNAi、 DnaseI footprinting 和酵母雙雜交等技術(shù)研究與珍珠質(zhì)量有關(guān)性狀相關(guān)的功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 闡明相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容： 1）構(gòu)建主要育種性狀的 GP 模型 ：描述基因和基因、以及基因和環(huán)境間相互作用及其對(duì)性狀的效應(yīng)，構(gòu)建基因型和表型性狀關(guān)聯(lián)的 GP模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，為貝類分子設(shè)計(jì)育種提供關(guān)鍵元件。找尋 SNP 位點(diǎn)和微衛(wèi)星位點(diǎn) ， 優(yōu)化大規(guī)模發(fā)掘 SNP 等標(biāo)記技術(shù)體系；對(duì)作圖家系進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 （ 2） 篩選出貝類生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因70 個(gè) 、抗病功能基因 1015 個(gè)、 與貝類珍珠質(zhì)形成相關(guān)的功能基因510 個(gè) ，建立家系等遺傳育種材料。 （ 3） 構(gòu)建主要育種性狀的 GP 模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫 。 （ 4）完成論文 4650 篇，其中 SCI收錄 46 篇，申請(qǐng)專利