【正文】 出假設(shè)； 5. 闡明 23 個(gè)關(guān)鍵抗病毒相關(guān)基因的抗病毒作用及其功能機(jī)理；闡明抗菌肽基因的抗細(xì)菌功能及其功能機(jī)理；鑒定魚類具有重要育種價(jià)值的與抗病性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記或功能標(biāo)記 23 個(gè)； 6. 建立育種上有價(jià)值的抗 細(xì)菌病的牙鲆等魚類雌核發(fā)育系和近交家系 5個(gè)左右； 7. 揭示 4 個(gè)重要抗寒基因的生物學(xué)功能 ； 鑒定 4－ 5 個(gè)有可能用于育種的抗寒基因 ； 獲得具有抗寒性能的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型 ； 8. MAPPING 到圖譜上 300 個(gè)標(biāo)記以上；建立后備親魚成熟的核心群體年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 100 尾以上；驗(yàn)證鯉魚和銀鯽 10 個(gè)左右基因與生長、抗?。购┗蝻暳限D(zhuǎn)化率等性狀的關(guān)聯(lián)性，驗(yàn)證 46 個(gè)QTL 或主效基因的遺傳效應(yīng)和育種潛力； 9. 建立穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和Cre/lox 基因靶位操作模型 ， 獲得EAF1 等 基因敲除斑馬魚的雜合子個(gè)體； 10. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活 的生長激素受體基因魚 F1 代 ， 完成原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的分子設(shè)計(jì) ， 揭示小 RNA作用的靶基因。 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫以及與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組 的進(jìn)一步 分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 差異順式調(diào)控序列與相關(guān)基因啟動(dòng)子差異甲基化修飾的關(guān)系分析； 4. 可控性卵巢發(fā)育抑制轉(zhuǎn)基因魚類模式品系的構(gòu)建； 5. 抑肌素信號通路研究； 6. 牙鲆抗病性狀關(guān) 聯(lián)分析基礎(chǔ)群體和 QTL 作圖群體構(gòu)建； 7. 抗 寒基因轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究 及 子一代 的 耐寒性能評估 ； 8. 遺傳圖譜構(gòu)建及其鯉魚 QTL 或主效基因在染色體上的同線性分析； 9. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率比較， Cre/lox 基因靶位操作效率分析 ， 基因敲除試驗(yàn) 和表型觀察 ； 10. 轉(zhuǎn)持續(xù)激活的生長激素受體基因 魚 P0 代的建立 ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的表達(dá)敲落 和啟動(dòng)子分析，小 RNA 動(dòng)態(tài)變化規(guī)律 和 互作蛋白的研究。 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院水生生物研究所、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 課題負(fù) 責(zé)人 ： 童金茍 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 孫效文 、王忠衛(wèi)、俞小牧、張驍鋒、耿波、賈智英、梁利群 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 6 基于魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)研究 主要研究目標(biāo)： 創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)；優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)；揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的新途徑，闡明 piRNA 與互作蛋白及其調(diào)控途徑；創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系；研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉(zhuǎn) 基因魚；揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長激素受體基因與轉(zhuǎn)生長激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應(yīng)及其信號通路的調(diào)控差異。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 廖小林 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 陳松林 張義 兵 、 朱蓉、袁秀平、沙珍霞 、 田永勝、王娜 、 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 4 魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；闡明魚類耐寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 主要研究內(nèi)容： 魚類生殖質(zhì) 的 成分解析及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類生殖質(zhì)主要成分的功能及其作用機(jī)制研究； 魚類配子發(fā)生過程中特異性甲基化等位基因功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類卵母細(xì)胞特異組蛋白、 Spindlin 在卵子成熟中的作用及調(diào)控機(jī)制研究； 魚類卵 胚轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制研究； 魚類性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能解析和作用機(jī)理研究； 魚類性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記的鑒定及其分子設(shè)計(jì)育種可行性研究。項(xiàng)目的主要研究內(nèi)容、課題設(shè)置的思路、各課題間的聯(lián)系和與項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和總體目標(biāo)的關(guān)系如下圖所示。本項(xiàng)目的研究內(nèi)容是在這些基礎(chǔ)上進(jìn)一步凝聚而來，目標(biāo)更為明確。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動(dòng)子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚類（斑馬魚、青 鳉 、河豚、三棘刺魚 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚類生殖、生長和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚類細(xì)胞系 魚類生殖、生長和抗性的主控基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時(shí)空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法 ChIP、 EMSA 等研究核酸與蛋白相互作用等方法 FACS、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；刃揎椃治? 魚類分子設(shè)計(jì)育種數(shù)量性狀多基因聚合技術(shù) 魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù) 多基因信息整合 性狀的 QTL 與 eQTL 分析 基因同線性與性狀關(guān)聯(lián)性分析 蛋白分子設(shè)計(jì)、 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除方法、 BAC 或Tol2 轉(zhuǎn)座子、 Cre/lox、 PGC 操作、miRNA和 piRNAs 調(diào)控 魚類生殖、生長和抗性 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析 魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性途徑 （三）、創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 1) 重要的研究對象，體現(xiàn)了國家重大需求導(dǎo)向： 本項(xiàng)目以我國重要養(yǎng)殖魚類鯽、鯉等為主要研究對象，圍繞水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新所要解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種 的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題開展研究，著眼于解決國家中長期發(fā)展中所需要解決的重大科學(xué)問題，體現(xiàn)了重大的國家需求導(dǎo)向。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測序等大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，了解魚類生殖和生長不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達(dá)譜差異，經(jīng)生物信息學(xué)比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚類生殖、生長、抗性的主要基因和關(guān)鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應(yīng)基因的啟動(dòng)子；將其啟動(dòng)子與 GFP 報(bào)告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細(xì)胞儀等篩選分析技術(shù)，進(jìn)一步研究生物學(xué)功能； 3. 建立魚類 BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當(dāng)位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚，通過 EGFP 分析這些基因的時(shí)空表達(dá)情況及其生理學(xué)效應(yīng)； 4. 通過基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎(chǔ)； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)序性 。 二、預(yù)期目標(biāo) 本項(xiàng)目的總體目標(biāo)： 針對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求，通過開展重要養(yǎng)殖魚類生殖、生長和抗性等主要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因組研究，解析魚類生殖的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚類抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的主控或關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，在理論上闡明魚類生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀和重要生命現(xiàn)象的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，提出魚類良種分子設(shè)計(jì)的策略；在技術(shù)方法上，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合和基因操作技術(shù)，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)育種材料，創(chuàng)建魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 3） 魚類抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細(xì)胞模型，重點(diǎn)解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；探討在魚類抗病免疫反應(yīng)中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能和抗病機(jī)理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法，開拓其可行性途徑。 2） 魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降、整體原位雜交、細(xì)胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細(xì)胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點(diǎn)解析魚類下丘腦/垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；探討腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚類肌肉細(xì)胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開拓生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基因用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長激素受體基因與轉(zhuǎn)生長激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應(yīng)及其信號通路的調(diào)控差異。 三、研究方案 （一）、學(xué)術(shù)思路： 針對 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求， 以鯽和鯉等為主要研究對象，啟動(dòng)我國 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究， 通過研究魚類生殖、生長和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù) 及其技術(shù)體系，解決魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題，為魚類分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐和應(yīng)用以及為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。將含有這些基因的真核表達(dá)載體，或在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 12. 對生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實(shí)驗(yàn)組和對照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達(dá)的時(shí)序性； 13. 對生長和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達(dá)具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細(xì)胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測定等方法研究其活性，測定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長激素的含量，分析這些生長調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號傳遞機(jī)制，分析它們對魚類生殖和生長的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實(shí)驗(yàn)室日常工作的、簡潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺(tái)；通過克隆獲得的魚類來源的啟動(dòng)子構(gòu)建針對草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞系，建立魚類培養(yǎng)細(xì)胞體外基因操作和個(gè)體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學(xué)功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號通路和作用機(jī)理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細(xì)胞模型，研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學(xué)功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標(biāo)記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因型分析的優(yōu)勢，研究特定標(biāo)記與某些經(jīng)濟(jì)性狀（例如生長、